葉 榕 林久茂 魏麗慧 莊群川 趙錦燕 彭 軍

?

白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)的影響*

葉 榕1林久茂2魏麗慧2莊群川2趙錦燕2彭 軍2＊

1.福建省衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

：觀察白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)的影響。：采用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29常規(guī)體外培養(yǎng)，隨機(jī)設(shè)定空白組和不同濃度(1、3、5mg/mL)白花蛇舌草乙醇提取物組，干預(yù)24h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；MTT法測(cè)定不同濃度藥物對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR檢測(cè)藥物作用后HT-29細(xì)胞Shh、Ptch、Smo和Gli-1 mRNA的表達(dá)。：白花蛇舌草乙醇提取物干預(yù)后，能抑制HT-29細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出量效作用；Shh、Ptch、Smo和Gli-1 mRNA表達(dá)隨藥物濃度的增加而減少。：白花蛇舌草乙醇提取物能抑制HT-29細(xì)胞與其可抑制Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表達(dá)有關(guān)。

白花蛇舌草 結(jié)腸癌 HT-29 Hedgehog

癌的形成是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，它涉及到一系列原癌基因異常的激活以及抑癌基因突變導(dǎo)致的失活，進(jìn)而引起一些信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常。目前已有研究顯示，Hedgehog(HH)信號(hào)通路異?；罨谠S多腫瘤包括基底細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌和一些消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程都起了重要作用[1]。同時(shí)HH作為潛在治療靶點(diǎn)為癌癥治療提供一個(gè)新機(jī)遇。

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd)的全草，其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等[2]，具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性，現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)就白花蛇舌草乙醇提取物(EEHDW)對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及HH信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響，為白花蛇舌草的深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物和細(xì)胞株

白花蛇舌草購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂醫(yī)院，批號(hào)：09072201。結(jié)腸癌細(xì)胞株（HT-29）購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉，Sigma公司；RT試劑盒、PCR試劑盒、TRIzol，Promega公司；PCR Master Mix（2×），F(xiàn)ermentas公司；PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

B-290型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)，瑞士Buchi公司；ELX800酶標(biāo)儀，BioTek公司；HF212UV二氧化碳培養(yǎng)箱，Heal Force；IX70熒光倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS；9600型PCR儀，美國(guó)PE公司；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀、水平式電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司；DU-650型蛋白核酸分析儀，美國(guó)Beckman公司；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 EEHDW的制備

白花蛇舌草全草，用10倍85%乙醇回流提取2次，合并后過(guò)濾，回收乙醇，濾液濃縮至相對(duì)密度1.05，經(jīng)噴霧干燥得粉末。得到提取物用40%DMSO溶解，配制成0.4g/mL溶液，經(jīng)高壓滅菌后于4℃保存待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。以RPMI1640培養(yǎng)液（含10%FBS）制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100uL，常規(guī)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。設(shè)EEHDW組(終濃度分別：1、3、5mg/mL)和對(duì)照組(直接加等體積的培養(yǎng)液)，各組的DMSO含量調(diào)整為一致，以上各組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸棄各孔中的液體，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液100uL，37℃孵育4h，然后吸棄各孔中的液體，每孔加入DMSO 100uL，振蕩混勻，室溫放置10min，使結(jié)晶充分溶解并混勻，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570nm測(cè)定各組吸光度值(即A值)，并按下列公式計(jì)算增殖抑制率：抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察EEHDW干預(yù)培養(yǎng)24h后的HT-29細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.7 mRNA表達(dá)分析

EEHDW對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞HH信號(hào)通路相關(guān)因子Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表達(dá)分析。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，取2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為（0、1、3、5mg/mL）4組，24h后進(jìn)行藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用Invitrigen公司的TRIzol，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取后的RNA經(jīng)紫外線分光光度計(jì)進(jìn)行純度及濃度的測(cè)定。

取溶于DEPC水中的RNA 1μg，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20μL體系)：cDNA 1μL，2×PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，加DEPC水至20μL，震蕩混勻，12000轉(zhuǎn)離心10s后，置PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，X℃退火30s,72℃延伸45s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，圖像分析儀照相和分析結(jié)果，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參(具體的退火溫度及引物序列見(jiàn)表1)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 EEHDW對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的影響

EEHDW對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖抑制作用隨濃度的加大而增大，抑制作用呈量效關(guān)系(圖1)。

圖1 不同劑量EEHDW對(duì)HT-29的抑制作用

2.2 EEHDW對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察，空白組HT-29細(xì)胞胞質(zhì)均勻，核仁清楚，伸展性好，生長(zhǎng)良好，形成貼壁的梭形細(xì)胞。隨著EEHDW作用濃度的增加，可觀察到細(xì)胞形態(tài)逐漸改變呈圓形，細(xì)胞數(shù)逐漸減少（圖2）。

2.3 EEHDW對(duì)HT-29細(xì)胞HH信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

HT-29細(xì)胞經(jīng)不同濃度EEHDW處理24h后，EEHDW能明顯下調(diào)Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表達(dá)（表2、圖3）。

A：對(duì)照組；B：1 mg/mL白花蛇舌草乙醇提取物組；C：3 mg/mL白花蛇舌草乙醇提取物組；D：5 mg/mL半枝蓮乙醇提取物組。

表2 EEHDW對(duì)HT-29細(xì)胞HH信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

注：與對(duì)照比較，*<0.01

圖3 EEHDW對(duì)HT-29細(xì)胞HH信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第4～6位，在世界范圍內(nèi)，以經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率為高，可高達(dá)30～50/10萬(wàn)[4]。近20年來(lái)，隨著生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)等因素的改變，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率亦呈逐年上升的趨勢(shì)[5]。目前結(jié)腸癌的治療，主要以手術(shù)為主的綜合治療，但其根治性手術(shù)切除后5年生存率僅為50%左右。術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的重要原因。因此術(shù)后配合以中醫(yī)中藥治療，對(duì)延長(zhǎng)患者生存期，降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，減輕放化療副反應(yīng)，改善生存質(zhì)量等均有重要意義[6]。已知，白花蛇舌草具有良好的抗腫瘤活性，廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療，并在對(duì)消化、呼吸、血液等系統(tǒng)的惡性腫瘤治療中取得了較好的療效。

HH信號(hào)通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，隨后又在脊椎動(dòng)物中被證實(shí)，是人類胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化的重要信號(hào)通路。目前認(rèn)為，該信號(hào)通路主要由Hh配體、兩個(gè)膜受體Ptch、Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli組成。Hedgehog基因在哺乳動(dòng)物中有三種同源基因：Shh、Ihh和Dhh，其中Shh對(duì)哺乳動(dòng)物的乳腺、前列腺、肺、毛發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)等多器官的發(fā)育起重要作用[7]。PTCH和SMO是細(xì)胞膜上兩種跨膜蛋白，在HH信號(hào)傳遞過(guò)程中起到受體的作用。Gli是HH通路末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，脊椎動(dòng)物存在三種Gli轉(zhuǎn)錄因子(Gli1、Gli2、Gli3)。Gli1是一種直接的轉(zhuǎn)錄激活因子，其激活調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，其mRNA的表達(dá)水平是反映HH信號(hào)通路活性的一個(gè)可靠指標(biāo)[8]。

HH信號(hào)通路成員基因的異常表達(dá)會(huì)啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞異常分裂增殖，從而導(dǎo)致腫瘤形成[9]。HH信號(hào)通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)，可能的致癌途徑有兩個(gè)：(1)通過(guò)配體Shh表達(dá)，內(nèi)源性Shh過(guò)表達(dá)，并和受體Ptch結(jié)合，從而解除后者對(duì)下游因子Smo的抑制作用，促使全長(zhǎng)的Gli進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)靶基因；(2)Ptch和(或)Smo發(fā)生突變，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)失控，靶基因不斷激活[10]。目前已有研究證實(shí)結(jié)直腸癌的發(fā)生與HH信號(hào)通路異常激活有關(guān)。ONISCU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)腸黏膜上均有Shh、Ptch、Smo的表達(dá)，而在增生性息肉、腺瘤、結(jié)腸腺癌中Shh、Ptch、Smo的表達(dá)水平明顯升高，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)外源性Shh能促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，而抗Shh抗體能抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖。DOUARD等[12]研究發(fā)現(xiàn)，86%結(jié)直腸癌病例的癌組織中存在Shh mRNA的過(guò)表達(dá)，Gli1的表達(dá)與Shh密切相關(guān)，外源性的Shh可以促進(jìn)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖，抗Shh抗體可以抑制腫瘤細(xì)胞株的增殖。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度（1、3、5mg/mL）的EEHDW對(duì)體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞的增殖均有抑制作用，藥物作用效果具有較明顯的量效關(guān)系。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29經(jīng)不同濃度EEHDW處理后，HH信號(hào)通路相關(guān)因子Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表達(dá)隨藥物濃度的增加而逐漸減弱，說(shuō)明白花蛇舌草可能通過(guò)抑制Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表達(dá)，從而達(dá)到抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的功效。

[1] 李曉偉，劉炳亞．Hedgehog信號(hào)通路在腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J]．生命科學(xué)，2009，21(1)：116-119.

[2] Lin CC，Ng LT，Yang JJ．Antioxidant activity of extracts of peh-hue- juwa-chi-cao in a cell free system[J]．Am J Chin Med，2004，32(3)：339-349．

[3] 宋立人．中華本草[M]．第1版. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999．

[4] 劉清華，熊建明，周樂(lè)杜．大腸癌的綜合治療[J]．中華現(xiàn)代外科學(xué)雜志，2005，2(2)：129-132.

[5] 謝正勇，卿三華．結(jié)直腸癌發(fā)病率及解剖部位變化趨勢(shì)[J]．世界華人消化雜志，2003，11(7): 1050

[6] 盧艷琳．中醫(yī)藥治療大腸癌研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，25(146)：28-30．

[7] McMahon AP. More surprises in the Hedgehog signaling pathway[J]. Cell，2000(100)：185-188.

[8] Osterlund T，Kogerman P．Hedgehog signaling：how to get from Smo to Ci and Gli[J].Trends Cell Biol，2006，16(4)：176-180．

[9] MuLlor JL，Sanchez P，RuiziAltabaA. Pathways and consequences：Hedgehog signaling in human disease[J].Trends Cell Biol，2002，12(12)：562-569.

[10] Berman DM，KarhadkarS，MaitraA，et al. Widespread requirement for Hedgehog ligand stimuLation in growth of digestive tract tumours[J].Nature，2003，425(6960)： 846-851.

[11] ONISCU A，JAMES R M，MORRIS R G. Expression of Sonic hedgehog pathway genes is altered in colonic neoplasia[J]. J Pathol，2004，203(4)：909-917.

[12] DOUARD R，MOUTEREAU S，PERNET P. Sonic Hedgehog-dependent proliferation in a series of patients with colorectal cancer[J].Surgery，2006，139(5)：665-670.

福建省自然科學(xué)基金（No.2010J01195）；福建省教育廳科學(xué)基金(No. JA10162)。

彭軍。