李建軍 宋曙霞 陳克芳 潘愛珍 黃啟輝 梁俊雄 易偉民

血瘀證是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的主要證型。證是遺傳和環(huán)境因素相互作用的病理表現(xiàn)，證與遺傳變異間的關系研究甚少，NO與血管緊張素II(AngII)生理作用相反，在血瘀證形成中有重要作用。本文就冠心病血瘀證與血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因多態(tài)性和內皮型一氧化氮合成酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因G894T變異的關系進行探討。

1 對象與方法

1.1 一般資料

從2010年6月至2011年3月，在廣州中山大學附屬第二醫(yī)院共診治廣東籍漢族冠心病患者160例，經中醫(yī)辨證分為血瘀證和非血瘀證，其中血瘀證組119例，其中男62例，女57例，平均年齡(64.4±10.62)歲。非血瘀證組41例，其中男21例，女20例，平均年齡(59.5±15.52)歲。

1.2 診斷標準

冠心病診斷參照1979年WHO制定的缺血性心肌病“心絞痛”、“心肌梗死”的診斷標準[1]，以患者臨床癥狀，體征和病史結合心電圖改變進行診斷，全部病例均經冠狀動脈造影。血瘀證診斷根據(jù)1986年中國中西醫(yī)結合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的血瘀證診斷標準[2]。

1.3 納入標準

(1)經冠狀動脈造影診斷，符合冠心病診斷標準；(2)符合中醫(yī)診斷標準。

1.4 排除標準

(1)有嚴重心、腎、肝、肺功能不全者；(2)半年內有外傷和外科手術史者；(3)合并惡性腫瘤者。

1.5 DNA提取

抽取患者2 ml靜脈血，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝，參照TaKara Company DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。

1.6 ACE基因型檢測

上游引物序列5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，下游引物序列5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’。引物均由達安基因公司合成。PCR反應條件：94℃預變性5分鐘→94℃變性30秒→62℃復性30秒→72℃延伸1分鐘，32個循環(huán)后72℃延伸10分鐘結束。取4 ul PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定分型，ACE基因上若存在Alu序列，PCR產物位490 bp，即為插入型(I型)；沒有Alu序列，PCR產物為190 bp,為缺失型(D)型，兩者都有則為(I/D)型。因此ACE基因型可分為II、I/D、DD三種基因型。

1.7 eNOS基因變異檢測

上游引物序列5’-CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC-3’，下游引物序列5’-AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC-3’。PCR反應條件：94℃預變性5分鐘→94℃變性30秒→60℃復性30秒→72℃延伸1分鐘，32個循環(huán)后72℃延伸10分鐘結束。取4 ul PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定分型，eNOS上若不存在變異，則PCR產物為206 bp，即為GG型，若存在變異序列，PCR產物即為119 bp，87 bp兩條帶即為TT型，若為GT型則產物出現(xiàn)206 bp,119 bp，87 bp三條帶。所有eNOS基因型可分為GG、GT、TT三種基因型。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 冠心病血瘀證組與非血瘀證組ACE基因型分布情況

160例冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因D等位基因及I等位基因分布頻率比較χ2= 0.117，P>0.05，兩組間無差異，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。 冠心病血瘀證和非血瘀證組ACE基因型比較χ2=0.009，P>0.05，兩組間無差異。見表1。

2.2 血瘀證組與非血瘀證組eNOS基因型比較

冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因G等位基因、T等位基因分布頻率比較χ2=0.427，P>0.05，兩組間無差異，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。冠心病血瘀證和非血瘀證組eNOS基因型比較χ2=0.78，P>0.05兩組間無差異。見表2。

2.3 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

比較冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布，血瘀證組DD、I/D型基因患者血管狹窄支數(shù)較II型多。選用精確概率法進行統(tǒng)計學分析，χ2=12.96，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與的eNOS基因型分布比較

選用精確概率法進行統(tǒng)計學分析，χ2=8.08，P>0.05，表明冠心病血瘀證各兼證血管狹窄支數(shù)與eNOS基因GG、GT、TT型分布無差異。見表4。

2.5 冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因型分布比較

經精確概率法分析，χ2=13.826，P<0.05，冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布差異明顯。隨著支架數(shù)的增多，II基因型分布減少。見表5。

2.6 冠心病血瘀證支架數(shù)與eNOS基因型分布

選用精確概率法進行統(tǒng)計學分析，χ2=3.9，P>0.05，冠心病血瘀證血管狹窄支數(shù)與eNOS基因GG、GT、TT型分布無統(tǒng)計學意義。見表6。

表1 冠心病血瘀證組與非血瘀證組ACE基因型分布

表2 冠心病血瘀證與非血瘀證組eNOS基因型比較

表3 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

表4 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與的eNOS基因型分布比較

表5 冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因型分布比較

表6 冠心病血瘀證支架數(shù)與eNOS基因型分布比較

3 討論

冠心病屬于中醫(yī)學“胸痹、心痛”范疇?！端貑枴っ}要精微論》云：“脈者……血之府也……澀則心痛，”強調胸痹心痛病位在心，病機關鍵在于血脈瘀阻。古今大量以活血化瘀藥為主組成的治療胸痹心痛的有效方劑，在臨床實踐中也證明了心血瘀阻是胸痹心痛的最主要病理改變。因此，血瘀證是目前研究冠心病證型的熱點。而冠心病血瘀證的現(xiàn)代研究多集中在血液流變學、凝血功能、血管內皮功能損傷、炎性介質等諸方面[3-5]，但與遺傳因素的關系研究甚少。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，冠心病是多基因遺傳與環(huán)境因素共同作用的結果。流行病學已證實：冠心病是一種遺傳疾病。目前發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性影響脂質代謝、血栓形成、血管舒張、收縮等病理生理過程，與冠心病發(fā)生的危險性增加具有密切相關性，其中以血管緊張素轉換酶基因多態(tài)性，內皮型一氧化氮合酶基因G894T變異的相關性研究較為深入。但結果不一。

ACE主要作用是催化血管緊張素I轉化為血管緊張素II，后者具有收縮血管、促進平滑肌增殖、促進血小板粘附和聚集等生理功能；ACE活性受基因調控，人類ACE基因的第16個內含子中存在287 bp的Alu重復序列，具有插入/缺失多態(tài)性,含有此片段的稱為“I”(Inserxion)，不含此片段的稱為“D”(Deletion)。實驗發(fā)現(xiàn)，DD型者血清ACE水平比II型者高出2倍，I/D型者ACE水平介于DD型及II型中間[6]。NaKai[7]的研究表明，ACE基因缺失型多態(tài)性不僅與血清ACE水平相關，并增加冠心病的危險性。云美玲等[8]比較海南漢族150例冠心病患者和150 例漢族正常人ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性檢測觀察DD，DI，II基因型頻率及等位基因頻率，認為ACE基因I/D多態(tài)性與漢族冠心病有顯著關聯(lián)，是漢族冠心病的致病的主要基因，ACE缺失多態(tài)性是漢族冠心病的獨立危險因素。但是，楊忠偉等[9]對新疆地區(qū)的類似研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族冠心病關聯(lián)性不大。

eNOS是心血管系統(tǒng)合成一氧化氮(NO)的主要酶，NO具有擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板粘附和聚集等生理功能[10]。eNOS基因編碼序列第894位堿基發(fā)生G突變?yōu)門(G894T)變異，可能與冠心病發(fā)病相關。Cuilin Zhang等[11]通過對861名糖尿病患者NOS基因G894T基因進行分析,其中220名患有冠心病患者為實驗組，641名沒有冠心病的患者為對照組，結果發(fā)現(xiàn)eNOS基因與冠心病的發(fā)生不具有相關性，并不會增加該病的危險性。彭瑾瑜等[12]對103例冠心病患者、104 例對照組eNOS基因G894T多態(tài)性的基因型，分析了它對冠心病的影響顯示：冠心病組和對照組eNOS基因G894T多態(tài)性的等位基因頻率差異相顯著(P=0.029)，認為冠心病組的eNOS基因G894T突變頻率比對照組高，T 等位基因可能與冠心病的發(fā)生有一定的關聯(lián)。但李敏等[13]通過Meta分析得出結論：eNOS基因G894T多態(tài)性的TT基因型會增加冠心病的發(fā)病危險,認為它可能是冠心病的遺傳危險因素之一。

冠心病血瘀證與ACE基因的相關研究國內的結果不甚一致。毛以林等[14]用PCR法檢測48例血瘀證和52例非血瘀證冠心病患者及54名健康人的ACE基因型，結果顯示冠心病血瘀證組ACE基因DD型及D等位基因頻率比非血瘀證組和健康對照組高(P<0.01)；DD型ACE基因可能為冠心病血瘀證發(fā)病的易感基因。黃獻平等[15]的研究也表明ACE基因DD型和D等位基因的頻率增高可能是冠心病心血瘀阻證易感基因型；認為可能與D等位基因導致AngⅡ異常增多有關。但是李杰等[16]在冠心病血瘀證家系中未發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)性與冠心病血瘀證存在明顯的相關性，認為該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因，只是冠心病血瘀證的發(fā)病危險因素之一。國內對冠心病血瘀證與eNOS基因的相關性研究未見報道。

本研究表明，冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因多態(tài)性、eNOS基因變異分布頻率無顯著差異，提示冠心病血瘀證與ACE基因和eNOS基因變異無明確相關性，說明ACE基因多態(tài)性和eNOS基因變異不是冠心病血瘀證的主要遺傳因素。但在比較血瘀證組和非血瘀證組血管狹窄支數(shù)及PCA支架數(shù)時發(fā)現(xiàn)ACE基因DD、I/D型較II型增多，間接提示血瘀證嚴重程度可能與ACE基因DD、I/D變異相關，當冠心病血瘀證有ACE基因DD、I/D變異時，可能存在冠狀動脈多支病變，病情嚴重，與王階等[17]的研究相一致。本研究的結果還提示，冠心病血瘀證存在復雜的遺傳背景，在今后的工作中需應用基因組學、芯片技術進行進一步深入研究。

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