林 志 呂建軍 屈 哲 李珊珊 張 迪 楊艷偉 李 波

單克隆抗體類藥物作為一種新型的生物技術藥物具有特定的免疫性。如果除了與適應證相關本身特定的靶器官外，人體正常組織細胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細胞結合，從而產生嚴重的不良反應［1］。因此單克隆抗體類藥物的免疫交叉反應在藥物臨床前的安全性評價中非常重要。根據FDA的相關規(guī)定，抗體類藥物的免疫交叉反應常常采用正常成人組織或相應的細胞株進行免疫組織化學或免疫細胞化學試驗［2］。然而，單克隆抗體藥物作為一種創(chuàng)新的生物技術藥物，尤其是全人源化單抗藥物的研發(fā)，其人體組織交叉反應在技術上仍存在很多困難，如何采用合適的免疫組織化學的方法是我們需要深入討論的問題［3］。本文擬通過兩種不同的單克隆抗體藥物進行組織交叉反應的比較研究，以探討免疫組織化學常規(guī)二步法和直接法在人體組織交叉反應研究中的應用。

材料與方法

1.單克隆抗體的準備:實驗采用了兩種不同的單克隆抗體藥物，分別為貝伐單抗(抗血管內皮生長因子受體單克隆抗體)和美羅華(抗CD20單克隆抗體，羅氏公司)。其中貝伐單抗為全人源化單克隆抗體，美羅華為人鼠嵌合型單克隆抗體。根據各抗體的預實驗結果，采用不同的抗體最佳濃度進行多種免疫組織化學方法的比較研究(表1)。

表1 不同免疫組織化學方法中兩種抗體的最佳濃度*

2.正常人體組織以及腫瘤組織的準備:貝伐單抗是抗血管內皮生長因子受體單克隆抗體(VEGF)，因此相應選用高表達VEGF的人血管肉瘤組織(由南京醫(yī)科大學提供)作為實驗對象。美羅華是抗B淋巴細胞表面抗原CD20的單克隆抗體，因此相應選用人淋巴結(由中國食品藥品檢定研究院提供)作為實驗對象。上述組織通過相關抗體證實其對應抗原均保存良好。

3.免疫組織化學方法:(1)常規(guī)二步法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加二抗(貝伐單抗為全人源化單抗，對應二抗為羊抗人多克隆抗體，北京中杉金橋有限公司提供;美羅華為人鼠嵌合型單抗，對應二抗為羊抗鼠F(ab)多克隆抗體，PIERCE公司提供)，37℃溫箱孵育60min;貝伐單抗采用DAB溶液顯色，美羅華采用堿性磷酸酶顯色;脫水透明后封片。(2)直接法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;內源性生物素封閉;滴加生物素標記的一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加鏈酶卵白素(streptavidin-HRP)，37℃溫箱孵育60min;DAB溶液顯色;蘇木精復染，自來水洗，鹽酸乙醇分化，返藍;脫水透明后封片。

4.免疫組織化學方法評分:貝伐單抗以腫瘤細胞胞質出現棕黃色顆粒為陽性信號，美羅華以淋巴結B淋巴細胞胞膜出現藍色顆粒為陽性信號。按Breasalier等［4］的方法判斷染色結果。在每張切片隨機選取10個視野，根據細胞染色強度分為4級，并分別記分，陰性:細胞無著色(0分)，弱陽性:淺黃色或淺藍色(1分)，中度陽性:棕黃色或藍色(2分)，強陽性:深棕黃色或深藍色(3分)。計算每一染色強度的細胞占視野的百分數，根據下列公式計算平均染色強度(insensity score)，IS=∑{〔0×F0〕+〔1×F1〕+〔2×F2〕+〔3×F3〕}，式中，F=每一強度細胞所占視野百分數×10視野。

5.統計學方法:所有實驗均重復3次，結果以均數±標準差(±s)表示。應用SPSS 11.0統計軟件對結果進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.貝伐單抗不同免疫組織化學方法的結果:采用直接法進行貝伐單抗的組織交叉反應，結果顯示陰性對照組背景干凈，血管肉瘤未著色，為陰性表達(圖1A)。實驗組采用生物素標記后的20μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈深棕黃色，為強陽性表達(圖1B)。采用常規(guī)免疫組織化學二步法進行貝伐單抗的組織交叉反應，結果顯示陰性對照組血管肉瘤組織中淋巴細胞及纖維組織呈淺黃色，為弱陽性表達，腫瘤細胞未著色(圖1C)。實驗組采用200μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈淺黃色，為弱陽性表達(圖1D)。如圖所示直接法可以有效地減低背景的非特異性染色，并且提高實驗的靈敏度，僅在20μg/ml就顯示出較好的染色結果。比較兩種方法，直接法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強度與陰性對照組存在顯著性差異(P＜0.01)，而常規(guī)二步法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強度與陰性對照組差異不明顯(圖2)。

圖1 貝伐單抗組織交叉反應不同方法的比較(×200)

圖2 貝伐單抗的組間平均染色強度差異性比較

2.美羅華不同免疫組織化學方法的結果:美羅華為抗CD20單克隆抗體，因此該抗體能與淋巴濾泡中的B細胞結合。采用直接法進行美羅華的組織交叉反應，結果顯示陰性對照組背景干凈，淋巴結濾泡(B細胞)及髓竇內未著色，為陰性表達(圖3A和圖3C)。實驗組采用生物素標記后的100μg/ml美羅華，僅在淋巴結髓竇內見巨噬細胞呈深棕黃色，為強陽性表達(圖3D)。采用常規(guī)免疫組織化學二步法進行美羅華的組織交叉反應，結果顯示陰性對照組淋巴結未著色(圖3E)。實驗組采用20μg/ml美羅華，淋巴結濾泡(B細胞)呈藍色，為陽性表達(圖3F)。如圖3所示，直接法未能有效地顯示美羅華與B細胞的結合，反而出現了髓竇巨噬細胞非特異性染色。常規(guī)二步法美羅華僅在20μg/ml就顯示出特異性的染色結果，淋巴濾泡B細胞呈藍色，為陽性表達。

討 論

1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立了雜交瘤技術，為單克隆抗體的研制和開發(fā)揭開了序幕。隨著轉基因技術的日臻完善，完全人源化抗體已經實現，即通過滅活小鼠內源性免疫球蛋白基因，再將人免疫球蛋白基因嵌于其基因組后產生［5］。由于該類生物技術藥物在疾病治療中廣闊的應用前景，單克隆抗體藥物成為了各國科學家研究的重要領域［6，7］。

圖3 美羅華組織交叉反應不同方法的比較(×200)

如果人體正常組織細胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細胞結合，從而產生嚴重的不良反應。因此單克隆抗體類藥物的組織交叉反應在藥物臨床前的安全性評價中非常重要［8］。免疫組織化學在很多技術上存在困難［9，10］。尤其是最近以來，完全人源化單克隆抗體藥物的研發(fā)成為熱點，這使得人源化單抗進行免疫組織化學研究中所選用的二抗為羊抗人抗體。因此，正常人組織能與二抗(抗人組織抗體)結合造成背景非特異性染色增強，很大程度上干擾了實驗結果。盡管有部分文獻提供了一些解決辦法，如采用與待測組織相同的5%的正常血清(人血清)稀釋二抗;采用經胃蛋白酶消化處理二抗使其不含Fc段;采用二抗相同種族的正常血清封閉切片等［11，12］。但是這只能部分解決非特異性染色的問題，目前仍沒有可接受的辦法。

本文通過兩種不同類型的單克隆抗體藥物貝伐單抗和美羅華，分別采用了常規(guī)二步法和直接法，進行了人體組織交叉反應。實驗結果表明貝伐單抗采用直接法，能夠有效地顯示出與血管肉瘤組織的結合，其特異性及敏感性都遠高于常規(guī)二步法。直接法采用生物素化的抗體，避免了抗人二抗的使用，減少了二抗與人體組織的非特異性結合。此外，通過鏈酶卵白素放大系統，放大了抗體與組織結合的效力。然而，美羅華實驗卻反應出相反的結果。生物素直接標記的美羅華與淋巴結B細胞未見結合，反而在髓竇內巨噬細胞出現非特異性的結合。采用常規(guī)二步法，美羅華與淋巴結B細胞出現特異性結合，并且由于美羅華是人鼠嵌合型單抗，二抗采用抗鼠的二抗，有效地減低了背景性的染色。

直接法與常規(guī)二步法對于單抗藥物的組織交叉反應各有利弊。直接法的優(yōu)勢在于其能有效地避免抗人抗體作為二抗的使用，從而降低了背景染色，有利于最終結果的判定。然而，生物素直接標記后無法確定是否改變了受檢單抗的結構特征，因而修飾過的抗體可能與其他非特異性抗原結合，提高實驗的假陽性。常規(guī)二步法的優(yōu)點在于直接受檢的單抗為一抗，因此抗體的特征與最終臨床使用的抗體藥物一致，結果最為真實地反映了藥物與靶位抗原的結合情況。但是，隨著全人源化單抗的日益增多，在常規(guī)二步法中需要應用抗人抗體作為二抗，這屆不可避免的造成二抗直接與人體組織標本的非特異性抗原結合，從而使得背景染色增強，干擾了最終結果的判定。

本文通過不同實驗方法的比較，采用兩種不同的單抗，發(fā)現不同的單抗適用不同的試驗方法。一般而言，以下循序適用于初次研究者進行人體組織交叉反應研究，即先采用常規(guī)二步法，如果背景染色過強時考慮換用直接法。最終試驗方法的確定取決于該單抗的組織交叉反應結果。有文獻報道，常規(guī)二抗法中二抗的選擇非常重要，避免選用Fc段的二抗可以在一定程度上改善結果［13～15］。當檢測抗體為全人源化抗體時，可以采用抗獨特型抗體作為二抗進行組織交叉反應。但是仍需要注意抗獨特型抗體是否結合內源性的IgG，并確定其不會改變測試抗體的親和力。在采用生物素標記抗體進行免疫組織化學染色時有兩個問題需要考慮:第一是必須對陰性對照抗體同時進行生物素標記，第二必須在加一抗前阻斷內源性的生物素。通常阻斷采用卵白素和生物素，并且需要采用去除一抗的染色以平行比較內源性生物素結合的情況。總之，組織交叉反應作為單克隆藥物的臨床前安全性評價的重要組成部分，只有提高是建立和完善該類創(chuàng)新生物技術藥物的臨床前安全性評價體系的基礎，才能促進我國生物技術藥物的蓬勃發(fā)展。

1 王軍志.生物技術藥物研究開發(fā)和質量控制［M］.北京:北京科學出版社，2007:363

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