操 芬 屠文展 程瑞動(dòng) 程 博 蔣松鶴

三磷酸腺苷(adenosine 5'－triphosphate，ATP)已經(jīng)被證實(shí)具有神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)作用，P2X3受體是ATP受體的一種亞型，屬配體門控型離子通道，可表達(dá)于初級(jí)傳入神經(jīng)元的胞體、中樞端和外周端，參與初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的痛覺(jué)及傷害性信息傳遞［1～3］。神經(jīng)病理痛和炎性痛刺激時(shí)，P2X3受體蛋白和mRNA表達(dá)增加，感覺(jué)神經(jīng)元P2X3受體介導(dǎo)ATP激活的門控通道電流明顯增強(qiáng)［4］。

繆刺為左病取右，右病取左的針刺方法，始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，多用于中風(fēng)偏癱、軟組織損傷及諸多疼痛癥。臨床上，繆刺足三里穴、陽(yáng)陵泉穴常用于治療腰腿痛，療效顯著，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)針刺大鼠足三里穴、陽(yáng)陵泉穴具有累積鎮(zhèn)痛效應(yīng)［5，6］。針刺的鎮(zhèn)痛機(jī)制復(fù)雜，Goldman等［7］研究發(fā)現(xiàn)針刺大鼠足三里穴后，穴位周圍ATP及其代謝產(chǎn)物腺苷等濃度明顯增高。因此嘌呤類物質(zhì)及其受體和針刺鎮(zhèn)痛之間的聯(lián)系引起了學(xué)者們的關(guān)注。Xiao等［8］研究證明電針坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)大鼠造模側(cè)足三里穴可引起CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾升高及中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)部P2X3受體表達(dá)升高。然而繆刺電針足三里穴、陽(yáng)陵泉穴對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)P2X3受體表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用CCI模型大鼠，通過(guò)繆刺電針和患側(cè)電針足三里穴、陽(yáng)陵泉穴，觀察大鼠造模側(cè)機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawal latency，TWL)的變化及P2X3受體蛋白在L4～L6DRG神經(jīng)元上的表達(dá)變化，旨在探討P2X3受體在繆刺電針抗慢性神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

材料與方法

1．主要試劑和儀器:兔抗大鼠 P2X3多克隆一抗(美國(guó)Millipore公司AB5895)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司 A0208)。336爪/尾刺激痛覺(jué)測(cè)試計(jì)以及2390 Electrovonfrey測(cè)痛計(jì)購(gòu)自美國(guó)ⅡTC公司。

2．動(dòng)物分組及CCI模型制備:清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠32只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重170～200g，隨機(jī)分為4組:假模組(只暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎不電針)、模型對(duì)照組(右側(cè)后肢造模不電針)、繆刺電針組(右側(cè)后肢造模后電針左側(cè)足三里穴，陽(yáng)陵泉穴)、患側(cè)電針組(右側(cè)后肢造模后電針右側(cè)足三里穴，陽(yáng)陵泉穴)，每組8只。

除假模組外，其余3組按Bennett等［9］模型制備方法建立大鼠CCI模型，5%水合氯醛(0．6ml/100g體重)腹腔注射麻醉，大鼠右側(cè)后肢股去毛備皮，常規(guī)消毒，沿右股骨下緣切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用4-0可吸收鉻制羊腸線在坐骨神經(jīng)分叉前打4個(gè)間隔1mm的松結(jié)，使神經(jīng)外膜稍稍受壓，松緊度以股肌肉或足指輕微抽動(dòng)為度。假模組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)2～3min，不打結(jié)，其余手術(shù)操作相同。CCI模型制備后大鼠出現(xiàn)跛行，足呈輕度外翻狀，且有時(shí)出現(xiàn)舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象，表明坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型制備成功。造完模后，各組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫22±2℃，相對(duì)濕度50% ～70%。

3．電針?lè)椒?CCI術(shù)后第8天，將大鼠固定于自制改良的大鼠針刺固定器，暴露針刺側(cè)肢體，相應(yīng)部位去毛備皮，安靜后用3mm皮內(nèi)針，針刺足三里穴，陽(yáng)陵泉穴(取穴標(biāo)準(zhǔn)按郭義主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［10］:足三里穴在膝關(guān)節(jié)下腓骨小頭下方約5mm處;陽(yáng)陵泉穴在膝關(guān)節(jié)下方，腓骨小頭前下方凹陷處)，垂直進(jìn)針3mm，用膠布局部固定，防止脫出。采用韓氏治療儀，2/100Hz交替脈沖連續(xù)刺激，每種波形持續(xù)2.5s，電流強(qiáng)度1mA(以腿部肌肉輕微抽動(dòng)為度)，持續(xù)30min，每日同一時(shí)段連續(xù)電針7天。假模組和模型對(duì)照組不予電針處理。

4．行為學(xué)測(cè)定:(1)機(jī)械縮足反射閾值(MWT):將大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱中，底為1cm×1cm的鐵絲網(wǎng)，待大鼠安靜后，用2390 Electrovonfrey測(cè)痛計(jì)的電子壓力傳感器探頭由下向上刺激大鼠右側(cè)后肢足底中部皮膚，垂直向上均勻緩慢增加力度至大鼠右后肢抽動(dòng)或抬足逃避，記錄此時(shí)電子顯示器上的數(shù)值(單位g)。測(cè)定時(shí)間為術(shù)前1天及術(shù)后3、5、7、10、12、14天，每次測(cè)定重復(fù)5次，間隔5min，取5次平均值。(2)熱縮足反射潛伏期(TWL):將大鼠置于底為3mm厚玻璃板的有機(jī)玻璃箱中，待大鼠在安靜后，用336爪/尾刺激痛覺(jué)測(cè)試計(jì)的燈光照射大鼠右后肢足底中部皮膚。熱輻射刺激儀參數(shù)設(shè)定:加熱頭空閑時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為20%，加熱頭測(cè)試工作時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為60%，切斷時(shí)間25s以防測(cè)試時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)動(dòng)物造成損傷，觸發(fā)溫度30℃。待大鼠右后肢抬起逃避時(shí)，切斷熱源，記錄此時(shí)的照射時(shí)間(s)。測(cè)定時(shí)間為術(shù)前1天及術(shù)后 3、5、7、10、12、14 天，每次測(cè)定重復(fù) 5 次，間隔10min，取5次平均值。

5．Western blotting法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá):術(shù)后第14天，腹腔注射10%水合氯醛(0．4ml/100g)麻醉后，冰上取L4～L6 DRG用于P2X3受體蛋白檢測(cè)。在冰上將L4～L6 DRG加組織裂解液(用Western及IP裂解液和PMSF配制，比例為99∶1)研碎，充分裂解，4℃，12000r/min×5min離心取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。各樣本按60μg/15μl蛋白上樣，70V和120V電泳后300mA濕轉(zhuǎn)40min，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST 漂洗 3×5min，P2X3一抗(1∶1000)4℃ 孵育18h，TBST漂洗3×10min后室溫下HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育1h，TBST 漂洗 3 ×10min，滴加 ECL 顯色，DNR Micro Chemi化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像。

6．圖像分析及數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:Alpha Ease FC(Fluorchem FC 2)軟件對(duì)Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以P2X3受體蛋白和內(nèi)參Actin平均光密度值的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，痛閾數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量的兩因素方差分析處理，平均光密度值的比值采用單因素方差分析后進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．CCI模型大鼠行為學(xué)觀察:CCI術(shù)后第1天大鼠出現(xiàn)行走時(shí)患肢拖動(dòng)，不能抬離地面，跛行，安靜時(shí)足呈輕度外翻狀，足趾不能承重或以膝關(guān)節(jié)承重，且有時(shí)出現(xiàn)舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象，日?；顒?dòng)及梳理皮毛動(dòng)作明顯較假模組減少。

假模組大鼠術(shù)前與術(shù)后比較，MWT和TWL無(wú)明顯差異。與假模組相比，CCI術(shù)后各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)MWT和TWL明顯降低(P均＜0．001)，其中模型對(duì)照組大鼠的MWT和TWL緩慢下降至術(shù)后第14天。電針治療后，繆刺電針組和患側(cè)電針組大鼠MWT和TWL均有不同程度的持續(xù)升高，與模型對(duì)照組相比差異顯著(P均＜0．05)。術(shù)后第14天，繆刺電針組和患側(cè)電針組相比無(wú)明顯差異(P＞0．05、圖1、圖 2)。

2．大鼠CCI術(shù)后L4～L6 DRG神經(jīng)元上P2X3受體蛋白表達(dá)變化:Western blotting分析結(jié)果提示，在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均觀察到在分子質(zhì)量48kDa處有免疫陽(yáng)性條帶，與已知的P2X3受體蛋白分子質(zhì)量符合。以Actin作為內(nèi)參蛋白，采用相對(duì)光密度值定量檢測(cè)結(jié)果。CCI術(shù)后第14天，與假模組比較，3組大鼠造模側(cè)L4～L6 DRG神經(jīng)元上P2X3受體蛋白表達(dá)上調(diào)(P均＜0.05)。經(jīng)電針干預(yù)7天后，繆刺電針組和患側(cè)電針組大鼠造模側(cè)L4～L6 DRG神經(jīng)元中P2X3受體蛋白表達(dá)均減少，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0．001)。繆刺電針組與患側(cè)電針組相比，L4～L6 DRG神經(jīng)元中P2X3受體蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05，圖3、圖4)。

討 論

1．足三里穴、陽(yáng)陵泉穴的解剖及信號(hào)傳導(dǎo):足三里屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，陽(yáng)陵泉屬足少陽(yáng)膽經(jīng)，二者解剖部位臨近，均在腓骨小頭附近，是臨床上治療坐骨神經(jīng)痛常用的兩個(gè)穴位?！夺樉膶W(xué)》［11］中記載:足三里在外膝眼下3寸，脛骨前嵴外一橫指處，穴深層為腓深神經(jīng);陽(yáng)陵泉在腓骨小頭前下方凹陷中，為足少陽(yáng)膽經(jīng)合穴，局部解剖正當(dāng)腓總神經(jīng)分為腓淺神經(jīng)和腓深神經(jīng)處，這些神經(jīng)正是坐骨神經(jīng)的分支。樓新法等［12，13］研究發(fā)現(xiàn)，足三里穴有一個(gè)神經(jīng)小分支和小血管密集區(qū)，位于脛骨前肌與骨間膜之間的疏松結(jié)締組織內(nèi)，并認(rèn)為針刺足三里穴區(qū)能通過(guò)腓深神經(jīng)和脛前動(dòng)脈壁上的神經(jīng)叢上傳針刺信號(hào)，直刺陽(yáng)陵泉略向下即可刺中腓總神經(jīng)分支其附近。在臨床研究中，趙敏生等［14］采用辣根過(guò)氧化物酶(CT－HRP)追蹤到大鼠左側(cè)足三里穴投射到脊髓的T12～S2節(jié)段，以L5～S2的標(biāo)記最多，本實(shí)驗(yàn)的取材正是 L4～L6 DRG，與足三里穴的投射區(qū)相吻合。

2．繆刺:繆刺是臨床常用的交叉取穴針刺方法，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載:“夫邪客大絡(luò)者，左注右，右注左，上下左右，與經(jīng)相干，而布于四末，其氣無(wú)常處，不入于經(jīng)俞，命曰繆刺”?？梢?，繆刺是一種左病治右，右病治左的取穴方法。目前，學(xué)者們對(duì)繆刺取穴的作用機(jī)制已進(jìn)行了探索，臨床上，肖葉玉等［15］通過(guò)磁共振功能成像研究表明直刺右側(cè)足三里可引起腦雙側(cè)多個(gè)功能區(qū)的激活。周誠(chéng)等進(jìn)行了針刺陽(yáng)陵泉穴fMRI腦功能成像的研究，結(jié)果顯示針刺陽(yáng)陵泉穴，同側(cè)枕葉視皮質(zhì)有明顯興奮區(qū)，雙側(cè)枕葉視皮質(zhì)都有明顯興奮區(qū)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)繆刺法對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)繆刺電針組和患側(cè)電針組造模側(cè)L4～L6 DRG神經(jīng)元上P2X3受體的表達(dá)均降低，與模型對(duì)照組相比均有顯著差異 (P＜0．001)，而繆刺電針組與患側(cè)電針組比較P2X3受體表達(dá)無(wú)明顯差異 (P＞0．05)，且電針7天后大鼠 MWT和 TWL均有不同程度的持續(xù)升高，繆刺電針組和患側(cè)電針組相比無(wú)明顯差異。這一結(jié)果提示繆刺電針和患側(cè)電針均能下調(diào)CCI大鼠造模側(cè)L4～L6 DRG上P2X3受體表達(dá)，減輕CCI大鼠機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏，考慮此結(jié)果的可能機(jī)制為繆刺電針和患側(cè)電針的針刺信號(hào)均能通過(guò)DRG傳導(dǎo)至脊髓，再上行至脊髓上中樞，如下丘腦、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、大腦皮質(zhì)等，引起腦內(nèi)雙側(cè)多個(gè)功能區(qū)的激活，從而對(duì)傷害性刺激引起的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)制，降低造模側(cè)L4～L6 DRG上P2X3受體表達(dá)，從而起到鎮(zhèn)痛作用。

3．DRG神經(jīng)元中P2X3受體和疼痛傳導(dǎo)的關(guān)系:DRG作為痛覺(jué)傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，在痛覺(jué)的外周機(jī)制中起著極為重要的作用。疼痛信號(hào)由DRG初步加工后傳入脊髓，再經(jīng)多條傳導(dǎo)束向高級(jí)中樞傳遞，最后到達(dá)大腦皮質(zhì)。DRG神經(jīng)元中不僅含有傳遞傷害性感覺(jué)的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，如速激肽、興奮性氨基酸等，也含有起突觸前調(diào)制作用的受體，如γ氨基丁酸(GABA)、阿片、嘌呤等受體，以及一些離子通道。這些物質(zhì)在疼痛的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。劉曉紅等研究表明坐骨神經(jīng)縮窄性損傷致神經(jīng)痛后同側(cè)對(duì)應(yīng)節(jié)段的背根節(jié)神經(jīng)元P2X3受體表達(dá)明顯增加，ATP快反應(yīng)電流明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組造模側(cè)L4～L6 DRG神經(jīng)元上P2X3受體蛋白表達(dá)量與假模組相比顯著升高，與以往研究報(bào)道相一致。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示繆刺電針和患側(cè)電針刺激大鼠“足三里、陽(yáng)陵泉”穴均可下調(diào)CCI大鼠造模側(cè)L4～L6 DRG神經(jīng)元上P2X3受體表達(dá)，為針刺鎮(zhèn)痛機(jī)制的進(jìn)一步研究和針刺鎮(zhèn)痛的臨床運(yùn)用提供了參考。

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