王燦，吳偉，孫佳，楊一龍

(1．沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034；2．沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2006級18班)

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，生產(chǎn)力的發(fā)展，生產(chǎn)勞動(dòng)中自動(dòng)化、機(jī)械化的程度越來越高，有越來越多的作業(yè)要求工人長期維持某種固定作業(yè)姿勢，靜力負(fù)荷所致肌肉損傷的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在一些工業(yè)化國家已成為主要的職業(yè)健康問題，歐美等國已將其列入職業(yè)病范疇。在我國職業(yè)性肌肉骨胳損傷也日益嚴(yán)重，有調(diào)查顯示黃石市冶金、建筑、紡織3種行業(yè)中行主要作業(yè)工人肌肉骨骼疾患的總患病率為87.32%[1]，鐵路機(jī)械工人肌肉肌膚損傷患病率為54.3%[2]。因此，研究靜力負(fù)荷所致肌肉損傷的機(jī)制和干預(yù)性因素，對于預(yù)防和治療這種損傷具有重要意義。目前研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)鈣失衡是長期靜力負(fù)荷致骨骼肌損傷的機(jī)制之一，維拉帕米是鈣通道阻滯劑，通過其干預(yù)，探討對骨骼肌損傷的保護(hù)作用，為此我們開展了本次研究，觀察線粒體生化指標(biāo)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(遼)2010-0002。選取24只雄性Wistar大鼠，體重200～220 g，隨機(jī)分為3組，即對照組、負(fù)荷組、干預(yù)組(干預(yù)劑+負(fù)荷)，每組8只。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，室溫20～22 ℃。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理方法 干預(yù)組在實(shí)驗(yàn)前30 min，給予干預(yù)劑維拉帕米，10 mg/kg左下肢肌肉注射。用2%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，剝離大鼠左下肢比目魚肌，將遠(yuǎn)端游離，給予100 g負(fù)荷，將大鼠固定在高60 cm的鐵架上，每組負(fù)荷90 min(圖1)。對照組以同樣的方式處理，不施加負(fù)荷。

圖1 左下肢比目魚肌施加靜力負(fù)荷的大鼠

1.2.2 大鼠血清、骨骼肌線粒體懸液的制備 施加負(fù)荷后在大鼠還處在麻醉狀態(tài)時(shí)，剖腹，剝離出腹主動(dòng)脈，用12號針頭經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min，離心15 min，取上層血清-20 ℃冷藏待測。采血完畢后，取0.7～0.75 g比目魚肌放入小平皿中，量取其質(zhì)量9倍的冷生理鹽水(單位為ml)，放入試管中。在4 ℃條件下用一次性吸管吸取生理鹽水加入小平皿中，用眼科剪子將組織剪碎，然后把組織全部轉(zhuǎn)移到手工勻漿器中，在冰上進(jìn)行手工研磨勻漿6～8 min，然后將勻漿液全部轉(zhuǎn)移到試管中，制得10%勻漿溶液，研磨后組織液經(jīng)3 000 r/min離心15 min，得到組織勻漿液。將組織勻漿液經(jīng)10 000 r/min離心15 min，上層為胞漿液，下層沉淀為線粒體，將得到的線粒體沉淀加生理鹽水2 ml，用玻璃勻漿器，手工勻漿6～8 min，得到線粒體懸液，整個(gè)處理過程在1～4 ℃條件下完成。

1.2.3 生化指標(biāo)測定方法 (1)血清肌酸激酶

(creatine kinase，CK)測定：其原理是：CK催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快全部水解為磷酸，此時(shí)三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍穩(wěn)定，加入鉬酸銨可生成磷鉬酸，可進(jìn)一步還原成鉬藍(lán)，根據(jù)生成無機(jī)磷的量可算出酶的活力。(2)血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定：其原理是：LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。(3)線粒體鈣濃度測定：取待測樣品0.1 ml于10 ml清潔小燒杯中，加5 ml濃硝酸(分析純)消化24 h，于自控電熱消化吸收器中(120 ℃)揮發(fā)至溶液無色，在原子吸收分光光度計(jì)上測定659 nm處吸光度值，并計(jì)算Ca2+含量，以每克蛋白水平(μmol/g)表示。線粒體蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)顯色劑測定。(4)線粒體Ca2+-Mg2+-ATPase測定：通過酶促水解ATP生成無機(jī)磷的水平來表示酶的活力，以mmol/g表示(試劑盒說明書上定義：規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位。即每小時(shí)每微摩爾分子磷/毫克蛋白)。(5)線粒體丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平測定：其原理是過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸光度。以每克蛋白表示(μmol/g)。CK、LDH、線粒體蛋白定量、Ca2+-Mg2+-ATPase、MDA均采用由南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定；Ca2+的含量用原子吸收光譜法測定。

2 結(jié)果

負(fù)荷組與對照組比較，大鼠血清CK、骨骼肌線粒體Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATPase、MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清LDH指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。負(fù)荷組與干預(yù)組比較，大鼠骨骼肌線粒體Ca2+、MDA指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 負(fù)荷組與對照組線粒體生化指標(biāo)比較

注：與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與負(fù)荷組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

3 討論

骨骼肌中CK是促進(jìn)肌肉收縮時(shí)被分解的ATP迅速再合成的酶，LDH是糖元無氧酵解代謝途徑的關(guān)鍵酶，正常時(shí)均存在于細(xì)胞內(nèi)，外周血中含量很少，研究證實(shí)肌肉損傷可以引起血清中一些與骨骼肌有關(guān)的酶的變化，并以此作為骨骼肌細(xì)胞膜通透性增加及細(xì)胞損傷的標(biāo)志。本次靜力負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果血清中CK活力負(fù)荷組與對照組比較增加50.43%，LDH二組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明骨骼肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)負(fù)荷下膜通透性增加或出現(xiàn)損傷，使CK大量從肌細(xì)胞中漏出，說明動(dòng)物造模成功。CK與LDH雖然都是肌細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志酶，但是CK的變化要早于LDH，持續(xù)時(shí)間小于LDH。有報(bào)道顯示，在運(yùn)動(dòng)后CK立即升高，而LDH在心梗發(fā)作后12～24 h開始升高。另外，LDH分子量為135～140 KD，大于CK(81 KD)，在通透性增加的一定范圍內(nèi)，LDH的變化不如CK敏感，這與其分子量的大小有關(guān)。

細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量約95%由線粒體通過電子傳遞鏈反應(yīng)，它通過氧化磷酸化生成ATP供給細(xì)胞需要。線粒體又是細(xì)胞鈣的緩沖器，具有攝取、釋放Ca2+以及調(diào)節(jié)胞漿Ca2+濃度的能力。同時(shí)線粒體是對缺氧最敏感的細(xì)胞器。所以當(dāng)大鼠骨骼肌長期處于靜力負(fù)荷下，引起局部肌肉緊張度增加， 壓迫血管，導(dǎo)致肌肉血液供應(yīng)不足和供氧不足，引起骨骼肌細(xì)胞損傷，造成Ca2+內(nèi)流，胞漿內(nèi)鈣離子增多，不能維持胞漿內(nèi)低鈣水平，線粒體主動(dòng)攝取過多的Ca2+以緩解漿中Ca2+的過度增加，而線粒體內(nèi)Ca2+濃度的增加將直接影響整個(gè)細(xì)胞的能量代謝和Ca2+的平衡。同時(shí)，缺血缺氧使肌肉無氧酵解增強(qiáng)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而破壞組織的抗氧化系統(tǒng)，其產(chǎn)物MDA 和自由基均可對膜系統(tǒng)造成攻擊，膜損傷的后果是氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP生成減少，失去動(dòng)力的鈣泵酶活力降低，加重鈣超載。線粒體Ca2+增高，Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降和MDA增多，三者交互作用，互相影響，從而影響線粒體正常功能。本實(shí)驗(yàn)負(fù)荷組與對照組比較，線粒體鈣濃度升高、ATP酶活性下降、MDA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明實(shí)驗(yàn)條件下的負(fù)荷強(qiáng)度可致骨骼肌線粒線生化指標(biāo)異常，負(fù)荷組可以作為干預(yù)組的對比觀察對象。負(fù)荷組與對照組比較，線粒體Ca2+濃度增加111.11%、Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降19.48%，MDA含量升高188.57%。表明在本實(shí)驗(yàn)負(fù)荷下線粒體中生物指標(biāo)發(fā)生了改變，Ca2+濃度增加會(huì)引起Ca2+超載，其結(jié)果可激活磷脂酶A2，使膜脂降解。其產(chǎn)物游離脂肪酸及溶血磷脂又會(huì)產(chǎn)生類似去垢劑樣作用，從而使線粒體內(nèi)膜通透性改變，影響線粒體的功能，導(dǎo)致細(xì)胞損害。Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降，會(huì)加重線粒體Ca2+超載的程度。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增加，表明自由基生成增多，均可成為細(xì)胞損傷的直接因素。

維拉帕米作為第一代鈣離子拮抗劑， 臨床上主要用于心律失常、心絞痛和高血壓的治療。近年來，除了傳統(tǒng)的藥用價(jià)值外，還廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，如對大鼠的心肌缺血再灌注的保護(hù)性研究[3]、對凍僵大鼠的肝臟和腎臟氧化損傷的保護(hù)性研究[4，5]和促進(jìn)大鼠的坐骨神經(jīng)再生的協(xié)同作用[6]。本研究顯示，給予維拉帕米后，干預(yù)組與負(fù)荷組比較，線粒體Ca2+水平下降228.85%、MDA含量下降49.16%，表明維拉帕米通過影響Ca2+內(nèi)流，可阻滯因鈣超載所啟動(dòng)的細(xì)胞損傷機(jī)制。干預(yù)組MDA含量的減少可能與維拉帕米能有效降低鈣超載有關(guān)，因鈣超載激活Ca2+依賴性蛋白酶，促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，致使活性氧生成增加。此外，鈣超載還可激活磷脂酶A2，通過環(huán)加氧酶和脂加氧酶在花生四烯酸形成過程中產(chǎn)生H2O2和·OH。提示用維拉帕米作為干預(yù)劑，可降低線粒體鈣超載及氧化損傷的作用。

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