代文博，米小軼，林紅，劉楠

(1． 沈陽市第一人民醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110041；2． 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室)

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，它可與多種腫瘤壞死因子受體和IL-1R/TLR家族成員結(jié)合，參與調(diào)節(jié)NF-κB和JNK等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，具有調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、參與炎癥反應(yīng)等多種功能[1]。TRAF1是TRAF家族成員中的一個(gè)分子，有研究表明TRAF1在鼻咽癌和淋巴瘤組織中表達(dá)升高[2-3]，但其在乳腺癌中的表達(dá)及意義尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用免疫組化和Western blot方法研究TRAF1在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)的變化情況，并分析其與微血管密度之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 70例乳腺癌組織包括35例非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(導(dǎo)管原位癌)和35例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除存檔蠟塊?；颊呔鶠榕?，中位年齡51歲(28～70歲)。對(duì)照標(biāo)本為癌旁非癌乳腺組織，經(jīng)病理確認(rèn)為正常乳腺組織共14例。

人雌激素依賴性受體乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(低侵襲)和人雌激素非依賴性受體乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(高侵襲)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 TRAF1鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。CD34鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)DACO公司。S-P超敏試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。辣根酶標(biāo)記第二抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DMEM低糖和RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶購(gòu)于GIBCO公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，以胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷液(37 ℃封閉10 min)，10%非免疫性動(dòng)物血清(37 ℃孵育40 min)，第一抗體(1∶50，4 ℃冰箱過夜)，生物素標(biāo)記的第二抗體(37 ℃孵育20 min)，S-A/HRP溶液(37 ℃孵育20 min)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞以常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法分別采用DMEM低糖和RPMI 1640培養(yǎng)液(每100 ml培養(yǎng)液中含10%的FBS，10 mmol/L Hepes，100 U/ml青、鏈霉素)在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 Western blot方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于4 ℃下加入裂解緩沖液(50 mmol/L、Ph 7.4 Tris HCl，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，1% Triton-100，1 mmol/L EDTA，1.2 μl/ml Aprotinin，6 μl/ml PMSF)，靜置30 min，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，30 min)，保留上清。采用Folin酚試劑法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，5%濃縮膠中恒壓(電壓80 V，電流0.01 A)電泳約15 min，12%分離膠中恒壓(電壓120 V，電流0.02 A)電泳約50 min后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印(恒壓，電壓40 V，2 h)，取出PVDF膜經(jīng)TBS液洗滌10 min后，封閉液封閉2 h，第一抗體(鼠單克隆抗體均為1∶150稀釋，兔多克隆抗體為1∶200稀釋)4 ℃過夜，辣根酶標(biāo)記第二抗體(1∶1 500稀釋)室溫孵育2 h，DAB顯色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定，對(duì)比兩種細(xì)胞系中表達(dá)的差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 TRAF1判定標(biāo)準(zhǔn)參見許良中等[4]的免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

CD34判定標(biāo)準(zhǔn)為：由內(nèi)皮細(xì)胞形成的條索、腔隙狀等孤立或簇狀結(jié)構(gòu)的棕黃色染色及有管腔者(管腔小于8個(gè)紅細(xì)胞大小的)按一條微血管計(jì)數(shù)。先在低倍鏡(×10)下找到腫瘤組織血管最密集區(qū)域，再在高倍鏡(×20)下計(jì)數(shù)3個(gè)不重復(fù)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為最終微血管密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，TRAF1在乳腺癌組織中的表達(dá)采用χ2檢驗(yàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)、與微血管密度之間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAF1在乳腺癌組織中的表達(dá) TRAF1在正常乳腺組織中不表達(dá)，表達(dá)于乳腺癌的腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)(圖1)。

圖1 TRAF1在正常乳腺(A)、非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(B)、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(C)組織中的表達(dá)(SP×400)

TRAF1陽性表達(dá)率在乳腺非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中高于正常乳腺組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽性表達(dá)率明顯高于非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 (P<0.05)，見表1。TRAF1表達(dá)與乳腺癌侵襲性相關(guān)。

表1 TRAF1在乳腺癌組織中的表達(dá)

注：1)與正常乳腺組織、非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌比較P<0.05

2.2 TRAF1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) TRAF1在乳腺癌高侵襲細(xì)胞系MDAMB-231的表達(dá)量高于低侵襲細(xì)胞系MCF-7，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 TRAF1在高、低侵襲乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)注：1．低侵襲細(xì)胞系MCF-7；2．高侵襲細(xì)胞系MDA-MB-231

2.3 TRAF1與微血管密度之間的關(guān)系 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，TRAF1陽性表達(dá)的微血管密度平均值(MVD)(80.96±13.77)明顯高于陰性表達(dá)組(66.08±24.24)(P<0.05)，TRAF1表達(dá)與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的微血管密度有關(guān)。

3 討論

TRAF家族成員是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，它一方面借助自身羧基端的TRAF同源結(jié)構(gòu)域，與不同的細(xì)胞表面受體蛋白相結(jié)合，另一方面它通過氨基端含有的環(huán)指/鋅指結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，將信號(hào)向下游傳遞[5]。

TRAF1是TRAF家族成員中的一種，在正常組織中表達(dá)較局限，只表達(dá)于脾、肺、睪丸。研究證實(shí)TRAF1是一種抗凋亡蛋白，TRAF1過表達(dá)抑制CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡[6]。Siegler等[3]研究表明TRAF1在霍奇金淋巴瘤中過表達(dá)。另有研究表明TRAF1在鼻咽癌中表達(dá)高于癌旁組織，提示其過表達(dá)可能發(fā)揮抑制癌細(xì)胞凋亡的作用[2]。Suqhra等[7]認(rèn)為TRAF1通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來發(fā)揮其抗凋亡功能。近來的研究表明，TRAF1-C5單核苷酸多態(tài)性還與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[8]。

腫瘤的血管生成為腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移提供了途

徑。TRAF信號(hào)通路中的一些分子如TNF、TWEAK 、NF-κB等均被證實(shí)具有促進(jìn)血管生成的功能[9-10]，而TRAF作為重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子是否具有促血管生成功能尚不知曉。

我們的研究結(jié)果表明，TRAF1在正常乳腺組織中不表達(dá)，在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織和非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，此外TRAF1在高侵襲細(xì)胞系中的表達(dá)也高于低侵襲細(xì)胞系，提示TRAF1表達(dá)量的改變可能與乳腺癌侵襲性相關(guān)。TRAF1在乳腺癌組織中的表達(dá)是否抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡仍需進(jìn)一步研究。此外，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中TRAF1與微血管密度呈正相關(guān)，提示TRAF1可能在乳腺癌的血管生成過程中發(fā)揮一定的作用。

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