周偉強，馮秀艷，李宇恒

(1．沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034；2．沈陽醫(yī)學院沈洲醫(yī)院醫(yī)務科；3．沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院2011級臨床醫(yī)學專業(yè)13班)

上呼吸道包括口腔、鼻咽部、氣管和支氣管，是與外界接觸的門戶，是病原生物體進入宿主體內的主要通道，有大量的細菌等微生物的積聚。宿主在正常狀態(tài)下能夠保持一種低度無菌的狀態(tài)，這和宿主防御機制有很大的關系[1，2]。近年來通過cDNA文庫篩選以及微芯片表達測定發(fā)現(xiàn)一類在上呼吸道上皮高表達，與上呼吸道宿主防御密切相關的蛋白家族—PLUNC( Palate， Lung， Nasal， cDNA )[3-5]。LPLUNC1作為PLUNC家族蛋白中的重要成員，從基因表達的方式、基因組的保守性以及蛋白結構預測分析來看，與殺菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/ permeability-increasing protein， BPI)高度相似[6，7]，BPI的主要作用是結合革蘭陰性菌細胞壁外圍的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)成分，阻止其介導的免疫反應。本文擬將LPLUNC1作為上呼吸道抗感染的候選分子，對其在宿主細胞內可能存在的抗感染防御機制做一初步的探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鼠源性RAW 264.7細胞系、pDNR-LIB質粒(american type culture collection， ATCC)；pGEX-4T3質粒、thrombin凝血酶(GE Healthcare)；綠膿桿菌LPS(Sigma-Aldrich)；B-PER GST 融合蛋白純化系統(tǒng)(Thermo Scientific)；鼠TNF-α Quantikine ELISA 試劑盒(R & D Systems)、鼠CD14 ELISA試劑盒(Cell Sciences)、細胞凋亡檢測ELISA試劑盒(Roche)；羊抗CD14單克隆抗體(Santa Cruz)；羊抗TNF-α多克隆抗體、羊抗β-actin抗體(Abcam)；羊抗GST多克隆抗體(GE Healthcare)；包被HRP的兔抗羊單克隆抗體(Bio-Rad Lab)。

1.2 RAW 264.7細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100 μg/ml青鏈霉素)在5%CO2、37 ℃飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3 GST-LPLUNC1融合蛋白的獲取 根據pDNR-LIB質粒中所包含的鼠源性LPLUNC1 cDNA全長序列應用Jellyfish生物軟件查詢其開放式閱讀框架區(qū)域(open reading frame， ORF)，經PCR亞克隆至pGEX-4T3 質粒中。GST-LPLUNC1-pGEX-4T3 重組質粒轉化至BL21 感受態(tài)細胞中大量增殖。GST-LPLUNC1融合蛋白經0.4 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)誘導、B-PER GST 融合蛋白純化系統(tǒng)處理后，抽取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳并用考馬斯亮藍染色觀察提取蛋白的純度，應用羊抗GST多克隆抗體進行Western blot進一步確定LPLUNC1-GST融合蛋白的存在，最后應用thrombin按1 U/100 mg蛋白濃度消化酶切GST標簽得到單一純化的LPLUNC1蛋白。

1.4 微量肉湯稀釋法測定細菌集落形成 將200 μl指數期生長的綠膿桿菌(P. aeruginosa，本室凍存)與MH肉湯(Mueller Hinton Broth，MH)混合后按4×105CFU/ml密度接種于96孔板各孔中。用0.01%的醋酸溶液倍比稀釋后的LPLUNC1蛋白溶液分別加到上述96孔板各孔中，第1至第4孔加LPLUNC1蛋白溶液，第5孔加0.1%人血清白蛋白溶液作為對照，每孔22 μl。第1孔至第4孔LPLUNC1蛋白終濃度分別為1.28、 0.32、 0.08、 0.02 mg/ml。按LPLUNC1蛋白液與綠膿桿菌液作用時間的不同，將實驗組分為：T(min)=0、30、60、120和240。待各孔中LPLUNC1蛋白與綠膿桿菌作用時間完畢后，各取出200 μl混合液接種于胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃孵育16～20 h后計數細菌集落形成數量評定結果。

1.5 體外LPS結合實驗 將綠膿桿菌的LPS和PBS混合成10 ng/ml溶液后，以200 μl/孔接種于96孔板中室溫過夜孵育。將含有完整LPLUNC1-GST融合蛋白按0、20、40 μg/ml濃度與上述各孔中混有綠膿桿菌LPS成分室溫作用3 h，加入40 μg/ml BSA作為陰性對照。待孵育完畢后加入羊抗GST多克隆抗體及包被HRP的兔抗羊單克隆抗體進行ELISA檢測相關樣品信號。

1.6 細胞凋亡測定 將1×104RAW 264.7 細胞接種于96孔板中37 ℃孵育24 h，加入200 μl 含有10 ng/ml LPS和1.28 mg/ml 純化LPLUNC1蛋白的培養(yǎng)液37 ℃孵育48 h。細胞經離心裂解后按細胞凋亡檢測ELISA產品說明書操作程序，測定樣品中組蛋白-DNA片段復合物的相對含量，評定LPLUNC1誘導靶細胞細胞凋亡的程度。

1.7 CD14， TNF-α ELISA、Western blot分析 將5×105RAW 264.7 細胞接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿37 ℃孵育24 h，加入10 ng/ml LPS和1.28 mg/ml 純化的LPLUNC1蛋白37 ℃孵育48 h。細胞經胰蛋白酶消化、離心后，取細胞上清液按鼠CD14抗原ELISA試劑盒和鼠TNF-α Quantikine ELISA 試劑盒產品說明書操作程序進行ELISA測定。同時將離心后的細胞團塊經B-PER裂解液裂解，應用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜、封閉。加入1∶1 000稀釋的羊抗CD14單克隆抗體、羊抗TNF-α多克隆抗體4℃孵育過夜，以羊抗β-actin抗體作對照。再加入1∶5 000包被HRP的兔抗羊單克隆抗體室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光測定細胞中CD14， TNF-α的表達。

2 結果

2.1 LPLUNC1融合蛋白的表達和純化 55 kDa LPLUNC1蛋白和26 kDa GST 蛋白經GST-Pulldown 蛋白純化系統(tǒng)擴增生成一約80 kDa LPLUNC1-GST的融合蛋白。20 μg蛋白樣品經SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后，從圖1-A中觀察到經原核細胞GST系統(tǒng)擴增，三次洗脫后得到大量純化的LPLUNC1-GST融合蛋白；圖1-B Western blot結果確定洗脫后獲得的蛋白為高純度的LPLUNC1-GST融合蛋白。

圖1 LPLUNC1融合蛋白的表達和純化注：A：SDS-PAGE電泳結果 B：Western blot 檢測LPLUNC1-GST融合蛋白 M： 蛋白分子量標準 E： 蛋白洗脫液 FT： 蛋白抽提液

2.2 LPLUNC1在宿主抗感染防御機制中的作用 將革蘭陰性菌綠膿桿菌與LPLUNC1按濃度及時間區(qū)段共同培養(yǎng)后分別計數細菌集落形成數量。結果表明，與單獨培養(yǎng)的綠膿桿菌對照組相比，無論LPLUNC1蛋白濃度的增加(0.02、0.08、 0.32、1.28 mg/ml)還是LPLUNC1作用時間的延長(0、30、60、120、240 min)對細菌集落的生成都不具有統(tǒng)計意義上的差異，這說明LPLUNC1沒有顯現(xiàn)出明顯的直接抑制細菌生長的特性(圖2-A)；但當其與綠膿桿菌的LPS成分共同孵育時，LPLUNC1表現(xiàn)出高度結合LPS的特性(圖2-B)。當測定LPLUNC1和LPS作用下靶細胞中組蛋白-DNA片段復合物含量時發(fā)現(xiàn)，LPLUNC1-LPS的結合沒有導致靶細胞內組蛋白-DNA片段復合物含量的明顯變化，由于組蛋白-DNA片段復合物含量反映細胞內發(fā)生凋亡的程度，因此LPLUNC1-LPS沒有誘導靶細胞發(fā)生細胞凋亡(圖2-C)。

圖2 LPLUNC1在宿主抗感染防御機制中的作用注：A： 微量肉湯稀釋法檢測LPLUNC1直接殺菌 B：LPLUNC1體外結合LPS實驗 C：LPLUNC1誘導細胞凋亡測定 * P<0.05

2.3 LPLUNC1-LPS抑制CD14介導的胞內信號轉導 在RAW 264.7細胞中加入LPS和LPLUNC1共同培養(yǎng)24 h后，ELISA測定細胞上清液中CD14和TNF-α含量，并用Western blot測定細胞裂解液中CD14含量。CD14、TNF-α ELISA(圖3-A，3-B)及CD14 Western blot(圖3-C)結果可見：LPS可誘導靶細胞膜上CD14受體以及細胞內細胞因子TNF-α的表達，LPLUNC1與LPS的結合大大抑制了作用效果，單獨應用LPLUNC1時，CD14及TNF-α表達不增強。由此可見，LPLUNC1是通過與LPS的結合，阻止CD14受體的激活，進而影響胞內細胞因子的表達，啟動宿主對感染的防御免疫反應。

3 討論

病原生物體粘附在宿主細胞或組織表面，克服機體局部的防御機制，特別是干擾或逃避宿主局部的吞噬作用及分泌抗體介導的免疫作用，持續(xù)存在或增殖引發(fā)感染。LPS作為革蘭陰性菌細胞壁的主要組分之一，對于激發(fā)人的免疫反應極其重要。在人體免疫系統(tǒng)對抗細菌入侵時，LPS作為重要的抗原分子可被抗原遞呈細胞(antigen presenting cell， APC)捕獲，從而引起機體的免疫反應。

圖3 LPLUNC1-LPS胞內信號轉導機制注：A： TNF-α ELISA結果 B：CD14 ELISA結果 C：CD14 Western blot結果 β-actin為內參對照 * P<0.05

一般認為，CD14在以革蘭陰性菌為主因的呼吸道感染中發(fā)揮重要的作用，它對于提升機體對革蘭陰性菌的免疫反應十分必要[8]。CD14按存在的部位可分為在單核細胞等細胞膜錨定存在的CD14(mCD14)和在正常人和動物的血清中游離存在的可溶性CD14(sCD14)兩種。mCD14是革蘭陰性菌感染信號傳播的關鍵，是機體對抗各種病原體、啟動早期免疫反應的關鍵受體[9]。有報道指出，CD14基因敲除小鼠(KO Mice)接種革蘭陰性致病菌-類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)后，細胞因子TNF-α表達量大為減少，而血液中細菌數量大為增加。這說明單核細胞等機體免疫細胞中的CD14受體功能對于調節(jié)LPS誘導細胞因子表達，激活免疫應答是非常重要的。CD14受體并不是隨著LPS刺激增強而無限表達，在感染中晚期，細胞膜上的mCD14大量脫落轉變?yōu)閟CD14，而sCD14可介導血液中單核細胞對細菌的吞噬作用，并使機體的炎性反應強度降低。

盡管目前LPLUNC1等PLUNC家族蛋白的功能還不是很清楚，但它與BPI、脂多糖結合蛋白(LPS-binding protein， LBD)在蛋白三維結構上高度同源，被認為是一種早期免疫分子，是革蘭陰性菌感染的傳感器。Vitorino等[10]就指出在受到外傷感染時，PLUNC蛋白在人和其它哺乳動物的唾液、鼻咽分泌物中表達水平大幅增強。有大量證據表明，PLUNC1家族蛋白可通過直接殺菌、結合LPS介導胞內細胞因子表達等多種方式參與宿主抗感染防御[11]。從我們的研究結果中可以看出，LPLUNC1沒有明顯的直接抑制革蘭陰性菌生長的特性，也不具備明顯的直接殺傷革蘭陰性菌的功能。從細胞凋亡測定來看，它也沒有誘導單核細胞凋亡的產生，但它可結合革蘭陰性菌LPS成分，具有高度敏感性，在LPLUNC1濃度很低時就可表現(xiàn)出高度結合LPS的能力。LPLUNC1與LPS的結合可競爭性抑制LPS與靶細胞膜表面CD14受體的結合，進而阻止信號轉導通路及相關胞內TNF-α等細胞因子的表達而促發(fā)宿主抗感染防御。

由于CD14受體胞內部分僅有一小段跨膜區(qū)，在介導LPS信號轉導過程中還需要細胞膜其它受體如TLR2、TLR4以及胞內MD-2(Myeloid differentiation factor-2)分子等進一步傳遞信號以達到激發(fā)胞內細胞因子表達的目的[12，13]，因此繼續(xù)尋找抗感染防御過程中可能存在的其它重要受體蛋白和激酶通路十分必要。本研究將LPLUNC1作為上呼吸道早期抗感染的候選分子，證實了LPLUNC1具有結合革蘭陰性菌LPS成分，抑制胞內細胞因子表達的特性，對于宿主早期抗感染防御啟動意義重大，對于預防上呼吸道感染、研發(fā)相關呼吸道疾病藥物都具有重要的臨床現(xiàn)實意義。

參考文獻：

[1]Beutler B． Innate immunity： an overview[J]． Mol Immunol，2004，40：845-859．

[2]Min-man W， Hong S， Zhi-qiang X， et al． Differential proteomic analysis of nasal polyps， chronic sinusitis， and normal nasal mucosa tissues[J]． Otolaryngol Head Neck Surg，2009，141(3)：364-368．

[3]Bingle CD， Bingle L． Characterization of the human PLUNC gene， a gene product with an upper airways and nasopharyngeal restricted expression pattern[J]． Biochim Biophys Acta，2004， 1493： 363-367．

[4]Bingle L， Cross SS， High AS， et al．SPLUNC1(PLUNC)is expressed in glandular tissues of the respiratory tract and in lung tumors with a glandular phenotype[J]． J Pathol，2005，205：491-497．

[5]Bingle CD， Craven CJ． PLUNC： a novel family of candidate host defence proteins expressed in the upper airways and nasopharynx[J]． Hum Mol Genet，2002，11：937-943．

[6]Leclair EE．Four BPI(bactericidal/permeability-increasing protein)-like genes expressed in the mouse nasal， oral， airway and digestive epithelia[J]． Biochem Soc Trans， 2003， 31：801-805．

[7]Ramadori G， Meyer zum Buschenfelde KH，Tobias PS， et al． Biosynthesis of lipopolysaccharide-binding protein in rabbit hepatocytes[J]． Pathobiology，1990，58：89-94．

[8]Schr?der NW， Opitz B， Lamping N， et al． Involvement of lipopolysaccharide binding protein， CD14， and Toll-like receptors in the initiation of innate immune responses by Treponema glycolipids[J]． J Immunol， 2000，165(5)：2683-2693．

[9]Wiersinga WJ， de Vos AF， Wieland CW， et al． CD14 impairs host defense against gram-negative sepsis caused by Burkholderia pseudomallei in mice[J]．J Infect Dis，2008 ，198(9)：1388-1397．

[10]Vitorino R， Lobo MJ， Ferrer-Correira AJ， et al． Identification of human whole saliva protein components using proteomics[J]． Proteomics，2004，4：1109-1115．

[11]Bartlett JA， Hicks BJ， Schlomann JM， et al． PLUNC is a secreted product of neutrophil granules[J]．J Leukoc Biol，2008，83(5)：1201-1206．

[12]Fitzgerald KA， Palsson-McDermott EM， Bowie AG， et al． Mal(MyD88 adapter-like)is required for TLR-4 signal transduction[J]． Nature，2001， 413：78-83．

[13]Hoshino K， Takeuchi O， Kawai T， et al． Cutting edge：toll-like receptor-4(TLR-4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide： evidence for TLR-4 as the LPS gene product[J]． J Immunol，1999，162：3749-3752．