劉志濤, 張 萍, 何國祥, 劉建平

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400038）

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention, PCI）治療術(shù)對(duì)動(dòng)脈的損傷會(huì)引起一系列的變化, 導(dǎo)致靶病變處血管新生內(nèi)膜形成及增生,造成再狹窄（restenosis, RS）。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的增殖和遷移是 RS 的主要病理機(jī)制[1]。組織損傷后傷口及其附近上皮存在的損傷電流場源是一種穩(wěn)恒直流電場,部分離體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn), 外加電場可以影響內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的增殖、遷移以及細(xì)胞的排列[2]。本研究探討外加穩(wěn)恒直流電場對(duì)兔腹主動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康日本大耳白兔 65只, 雌雄不限, 體質(zhì)量（1.98±0.23）kg, 由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依照第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)許可的協(xié)議進(jìn)行。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=5）、假手術(shù)組（n=24）及實(shí)驗(yàn)組（n=36）。假手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組手術(shù)過程完全相同, 也埋置電極但不給予電場刺激。假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組分別觀察至術(shù)后1天、1周、2周以及4周, 實(shí)驗(yàn)組根據(jù)施加電場強(qiáng)度不同分為3.0V/cm和4.0V/cm兩個(gè)亞組, 術(shù)后第2天開始電治療。

1.2 主要試劑、材料和儀器

HE染色; 天狼猩紅購自海泛柯生物科技有限公司; 鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體購自 Abcam 公司; 鼠抗兔Ⅲ型膠原單克隆抗體購自 Calbiochem公司; GAPDH（V-18）購自Santa Cruz公司; WYJ數(shù)字顯示高精度直流穩(wěn)壓電源購自上海山杰科技有限公司; Western blot凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司; 顯微鏡下圖像應(yīng)用 Olympus BX51顯微圖像采集系統(tǒng)采集; 圖像分析均使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件; Western blot結(jié)果分析使用 Quangtity One軟件。自制鉑電極（電極直徑0.40 mm, 長20 mm,導(dǎo)線長約30 cm）。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥1ml/kg麻醉。分離兔右側(cè)股動(dòng)脈約 2～3cm 長, 縱向逐層切開下腹壁暴露腹腔, 顯示腹主動(dòng)脈下段與髂總動(dòng)脈分叉處。從股動(dòng)脈插入帶有PTCA導(dǎo)絲支持的2.5 mm×20.0 mm PTCA球囊, 推送至腹主動(dòng)脈下段, 使球囊頭端距離腹主動(dòng)脈分叉處5.0 cm。球囊加壓至12標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（atmospheric pressure, atm）后, 回拉球囊直至髂總動(dòng)脈分叉處, 然后釋放壓力。以上過程共3次, 每次間隔時(shí)間1min。術(shù)畢, 撤出球囊導(dǎo)管, 結(jié)扎股動(dòng)脈近端。將兩針狀鉑電極分別插入兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌縫扎固定, 保持兩電極平行, 電極距離腹主動(dòng)脈約 1cm, 電極下端與腹主動(dòng)脈與髂動(dòng)脈分叉處持平。將兩電極導(dǎo)線通過皮下隧道引至兔頸后,縫扎固定于體外。慶大霉素溶液沖洗腹腔后, 逐層縫合皮下及皮膚, 青霉素400 000U肌內(nèi)注射3d。

1.4 血管新生內(nèi)膜增生的觀察

將 10%中性甲醛固定的血管組織常規(guī)石蠟包埋,切片, HE染色后顯微鏡下觀察, 通過計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0分析內(nèi)膜、中膜面積, 計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比值。

1.5 天狼猩紅染色

將石蠟包埋的血管組織切片, 用天狼猩紅染色,在暗視野條件下, 偏振光顯微鏡觀察。天狼猩紅染色后, 膠原纖維呈現(xiàn)不同的折光性和顏色, Ⅰ型膠原纖維緊密排列, 顯示很強(qiáng)的雙折光性, 為黃色或紅色的纖維。Ⅱ型膠原纖維有弱的雙折光性, 為各種不同顏色的疏松網(wǎng)狀。Ⅲ型膠原纖維顯示弱的雙折光性, 呈綠色的細(xì)纖維。

1.6 Western blot測定血管組織I型、III型膠原蛋白表達(dá)

血管組織中總蛋白提取后, 蛋白質(zhì)定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測定樣品濃度, 灌制 10%SDS-PAGE, 上樣量為 30μg, Bio-Rad公司 Mini系電泳槽進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)至 PVDF膜, 加入一抗、二抗等系列操作后用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描成像, 并用Quantity One-4.4.0圖像分析軟件進(jìn)行分析, 蛋白表達(dá)量以“目的蛋白/GAPDH”的光密度比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用±s表示。采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析,L.S.D-t檢驗(yàn)及Dunnett-t檢驗(yàn)作為驗(yàn)后多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

本研究65只動(dòng)物中, 1只動(dòng)物死于腹腔感染, 1只死于腸梗阻, 1只無明顯原因死亡, 將這3只動(dòng)物剔除。其余兔健康存活, 納入研究。

2.2 外加電場對(duì)血管損傷后內(nèi)/中膜面積比值的影響

HE染色后光鏡下觀察可見, 假手術(shù)組正常動(dòng)脈內(nèi)膜僅見單層內(nèi)皮細(xì)胞, 內(nèi)皮層下未見有中膜VSMCs潛入。球囊損傷1d后, 動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫, 管腔內(nèi)表面尚無增殖的VSMCs。內(nèi)膜損傷后1周, 新生內(nèi)膜形成并逐漸增厚, 其中可見較多增殖的VSMCs,分布不均, 排列紊亂, 內(nèi)/中膜面積比為（8.43±1.39）%。內(nèi)膜損傷2周后, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加,最厚處約為中膜厚度的 1/2, 內(nèi)/中膜面積比為（20.88±1.84）%。損傷后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚,最厚處約等于中膜厚度, 內(nèi)/中膜面積比為（46.92±5.79）%。在3.0V電場干預(yù)組, 內(nèi)膜損傷后1周、2周及 4周內(nèi)/中膜面積比分別為（8.28±1.31）%,（16.12±2.65）%, 及（28.07±3.63）%, 與對(duì)照組相比顯著減?。≒＜0.01）。在4.0V電場干預(yù)組, 內(nèi)膜損傷后1周、2周及4周內(nèi)/中膜面積比分別為（7.93±1.76）%,（14.80±1.51）%及（27.58±4.27）%, 也明顯小于假手術(shù)組（P＜0.01）, 但與3.0V組比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05; 圖1, 圖2）。

2.3 外加電場對(duì)血管損傷后Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響

天狼猩紅染色后偏振光纖維鏡下觀察, 可見各組血管壁內(nèi)較豐富橙黃色Ⅰ型膠原, 主要分布于外膜, 僅有較少量綠色Ⅲ型膠原表達(dá)。術(shù)后1周, 各組新生內(nèi)膜已形成, 但內(nèi)膜中未見橙黃色和綠色條紋。術(shù)后2周, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加, 內(nèi)膜中可見少許橙黃色條紋, 在電場干預(yù)3.0V、4.0V組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 內(nèi)膜中未見橙黃色條紋; 術(shù)后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚, 新生內(nèi)膜中可見較多的橙黃色斑條紋, 并有少許綠色細(xì)條紋夾雜其中, 在電場干預(yù)3.0V、4.0V組, 新生內(nèi)膜厚度小于假手術(shù)組, 新生內(nèi)膜中的橙黃色斑條紋較對(duì)照組顯著減少（圖3, 圖4）。Western blot結(jié)果顯示, 在術(shù)后4周,無論是3.0V還是4.0V實(shí)驗(yàn)亞組, 其I、III型膠原蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05; 圖5, 圖 6）。

3 討 論

血管損傷后的內(nèi)膜增生是一個(gè)復(fù)雜的過程。內(nèi)皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)血栓形成, 血栓形成后的 24h內(nèi),VSMCs即開始增生。正常內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生很多因子如前列環(huán)素和硫酸類肝素等, 這些物質(zhì)抑制VSMCs增殖[3]。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生硫酸類肝素量減少, 同時(shí)由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的其他抑制VSMCs增殖的因子如一氧化氮的產(chǎn)量亦降低, 而死亡或損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs釋放許多促增殖物質(zhì), 刺激VSMCs增殖[4]。因此, 血管壁損傷后降低了抑制性生長因子的產(chǎn)量而增加了刺激性生長因子的表達(dá)量, 使其平衡向有利于VSMCs增殖的方向移動(dòng)。新生內(nèi)膜的最終形成是 VSMCs通過增殖聚集, 持續(xù)性遷移或者是兩者的結(jié)果, 同樣也是大量細(xì)胞外基質(zhì)合成的結(jié)果。VSMCs聚集過程和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生緊密聯(lián)系, 刺激 VSMCs增殖的相同因子, 同時(shí)也增加細(xì)胞外基質(zhì)的含量[3]。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)/中膜面積比Figure 1 Ratio of the tunica intima area to media area of the neointima

圖2 各組不同時(shí)相點(diǎn)新生內(nèi)膜增生情況Figure 2 Neointimal formation of the abdominal aorta after balloon injury operation in different groups (HE×100)

圖3 天狼猩紅染色術(shù)后4周各組間內(nèi)膜Ⅰ型膠原比較Figure 3 Expressions of type-I collagens in different groups at 4 weeks after surgery (Sirius red dye staining)

圖4 術(shù)后4周各組間內(nèi)膜Ⅰ型膠原單位面積光密度值比較Figure 4 Absorbance value of type-I collagens in different groups at 4 weeks after surgery

圖5 Western blot檢測血管Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of type-I collagens detected by western blot

圖6 Western blot檢測血管Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of type-III collagens detected by western blot

唐波等[5]的研究發(fā)現(xiàn), 在外加直流電場的作用下, VSMCs 向電場陰極面作定向遷移, 遷移速度也明顯增加, 電場作用下 VSMCs 的定向遷移是與細(xì)胞生長相關(guān)的一種主動(dòng)行為, 而不是在電場作用下的一種被動(dòng)的泳動(dòng)。Azadniv 等[6]的研究也發(fā)現(xiàn),外加電場可以抑制體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖。以上研究均表明, 外加電場可以影響 VSMCs的增殖和遷移。本研究中發(fā)現(xiàn), 球囊損傷后2周及4周,新生內(nèi)膜厚度顯著增加; 3.0V及4.0V實(shí)驗(yàn)亞組內(nèi)皮損傷后 2周及 4周的內(nèi)/中膜面積比均顯著小于對(duì)照組（P＜0.05,P＜0.01）, 但不同實(shí)驗(yàn)亞組間相比, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明外加一定強(qiáng)度范圍的穩(wěn)恒直流電場可以抑制新生內(nèi)膜的形成。

目前的研究表明, 細(xì)胞外基質(zhì)的重建, 尤其膠原纖維的重建（Ⅰ型、Ⅲ型膠原）與 VSMCs遷移和增生有密切的關(guān)系, 血管內(nèi)膜損傷后增生的細(xì)胞外基質(zhì)主要來自于中膜的 VSMCs和外膜活化后的肌成纖維細(xì)胞, 細(xì)胞外基質(zhì)是 VSMCs增殖所必需的。Abid等[7]的研究顯示, 自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖的同時(shí),Ⅰ, Ⅲ型膠原 mRNA的表達(dá)增加, VSMCs增殖伴細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。血管細(xì)胞外基質(zhì)是維持血管壁結(jié)構(gòu)完整和功能正常的必要保證,正常動(dòng)脈血管中的膠原以Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型為主,主要由VSMCs合成分泌[8]。

我們的研究發(fā)現(xiàn), 天狼猩紅染色后偏振光纖維鏡下觀察, 正常血管壁內(nèi)的膠原以Ⅰ型膠原為主,主要分布于外膜, 少量Ⅲ型膠原夾雜其中, 明顯少于Ⅰ型膠原。術(shù)后1周, 各組新生內(nèi)膜已形成, 但內(nèi)膜中均未見Ⅰ, Ⅲ型膠原。術(shù)后2周, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加, 內(nèi)膜中可見少許Ⅰ型膠原, 在3.0V, 4.0V實(shí)驗(yàn)亞組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 內(nèi)膜中未見Ⅰ,Ⅲ型膠原; 術(shù)后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚, 新生內(nèi)膜中可見較多的Ⅰ型膠原, 并有Ⅲ型膠原夾雜其中;3.0V和4.0V實(shí)驗(yàn)亞組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 新生內(nèi)膜中的Ⅰ型膠原明顯少于對(duì)照組。3.0V和4.0V亞組之間內(nèi)膜膠原含量未見差異。這表明外加電場在抑制新生內(nèi)膜形成的同時(shí)也抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。Western blot結(jié)果顯示, 在術(shù)后4周, 3.0V亞組、4.0V亞組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比, 差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 3.0V亞組、4.0V亞組Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 表明電場干預(yù)沒有改變血管壁總的膠原蛋白含量, 這可能是因?yàn)檠鼙诳偰z原蛋白主要由血管外膜膠原蛋白組成, 血管內(nèi)膜內(nèi)的膠原蛋白含量變化對(duì)血管總膠原蛋白含量的變化無明顯影響。

既往有研究發(fā)現(xiàn), 外加電場可以促進(jìn)新生內(nèi)膜增生, 從而形成管腔的狹窄, 這一作用甚至被人們用來制作血管損傷模型[9]。但在這些研究中產(chǎn)生血管損傷作用的電場均為高頻脈沖電場, 刺激電流均高于 1mA, 并且刺激電極與血管外膜緊密接觸, 而我們采用的是低壓穩(wěn)恒直流電場, 刺激電極置于腰大肌內(nèi), 不與血管直接接觸, 經(jīng)過血管的電流極小。這可能是本研究中血管產(chǎn)生不同效應(yīng)的主要原因。

總之, 外加適宜的低壓穩(wěn)恒電場可以抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成, 同時(shí)抑制血管內(nèi)膜 I型膠原蛋白的生成, 這可能有助于改善血管損傷后內(nèi)皮依賴性舒張功能。

[1]Slavin L, Chhabra A, Tobis JM. Drug-eluting stents:preventing restenosis[J]. Cardiol Rev, 2007, 15(1): 1-12.

[2]唐 波, 何國祥. 電場對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 國外醫(yī)學(xué)心血管疾病分冊, 2003, 30(6): 350-353.

[3]Sottirurai VS, Yao JST, Batson RC,et al. Distal anastomotic intimal hyperplasia: histopathologic character and biogenesis[J].Ann Vasc Sung, 1989, 3(1): 26-33.

[4]Kairuz EM, Barber MN, Anderson CR,et al. C-type natriuretic peptide (CNP) suppresses plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)in vivo[J]. Cardiovasc Res, 2005, 66(3):574-582.

[5]唐 波, 何國祥, 劉建平, 等. 電場干預(yù)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的影響[J]. 中國臨床康復(fù), 2006, 10(21):70-72.

[6]Azadniv M, Miller MW, Cox C,et al. On the mechanism of a 60-Hz electric field induced growth reduction of mammalian cellsin vitro[J]. Radiat Environ Biophys, 1993,32(1): 73.

[7]Abid MR, Yano K, Guo S,et al. Forkhead transcription factors inhibit vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia[J]. J Biol Chem, 2005, 280(33):29864-29873.

[8]杜瑤瑤, 王 憲, 孔 煒. 細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)水解酶與血管鈣化[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2008, 39(3): 203-208.

[9]Carmeliet P, Moons L, Stassen JM,et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice[J]. Am J Pathol, 1997, 150(2): 761-776.