張如華,徐雙兵,武遠(yuǎn)眾,康鐵邦

(華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部,廣東 廣州 510060)

細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜的過程，其精確調(diào)控是維持基因組穩(wěn)定性以及細(xì)胞正常功能的必要條件[1]。已有研究表明很多種調(diào)節(jié)蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，包括cyclins(細(xì)胞周期素)，CDKs(Cyclin-dependent kinase 周期素依賴性激酶)以及 CDK 抑制分子[2,3]。為確保細(xì)胞周期正常運(yùn)行，細(xì)胞內(nèi)自發(fā)形成了許多的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)就是其中重要的一種調(diào)控機(jī)制，如果其激活缺陷就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂，從而有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。

hSSB1是最近發(fā)現(xiàn)的一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，是參與調(diào)控細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的一個(gè)重要分子[5]。缺失hSSB1的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)的激活缺陷，放射敏感性增加以及基因組的不穩(wěn)定性[5]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)hSSB1可以和p21相互作用從而調(diào)控細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的運(yùn)行，而且hSSB1在人類肝癌組織中呈高表達(dá)[6]，但其高表達(dá)后對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響目前并不清楚。在本研究中，擬構(gòu)建hSSB1高表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-hSSB1，并進(jìn)行高表達(dá)穩(wěn)定株的篩選，為進(jìn)一步研究hSSB1的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

HeLa,HepG2和HEK293T細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤防治中心保存。pBABE-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(含有嘌呤霉素抗性基因)為中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院陳雯教授饋贈(zèng)。PIK病毒包裝質(zhì)粒由中山大學(xué)腫瘤防治中心曾木圣教授饋贈(zèng)。BamH I、SalI內(nèi)切酶以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為MBI Fermentas公司產(chǎn)品,T4 DNA Ligase購(gòu)自Takara公司，質(zhì)粒小提試劑盒和切膠回收試劑盒均購(gòu)自Qiagen公司，2×Taq PCR MasterMix 購(gòu)自北京天根公司。Trizol試劑和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。兔抗人hSSB1多克隆抗體為Bethyl公司產(chǎn)品,鼠抗人HSP70 抗體購(gòu)自Santa Curz 公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α以及HRP羊抗兔和鼠二抗均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。Polybrene和puromycin均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HeLa細(xì)胞總RNA 的提取 按照Trizol 試劑說明書步驟提取總RNA。收集所培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，6孔板中每孔加入1 mL Trizol 試劑，室溫靜置5 min。加入氯仿0.2 mL，充分混勻，室溫靜置2～3 min 后，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的無(wú)RNA酶的EP管中，加入500 μL的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min。4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入φ=75％乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min 離心5 min。棄上清，室溫干燥5～10 min，加入20 μL DEPC 處理水，58 ℃水浴10 min，得到的RNA保存于- 80 ℃。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 的基因序列(NM_024068)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增hSSB1編碼區(qū)cDNA上、下游引物。上、下游引物中分別引入BamHI、SalI酶切位點(diǎn)。GAPDH引物序列同前[7]。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增基因所需的引物

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) RNA用分光光度計(jì)測(cè)濃度后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，選用MBI Fermentas 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit.按試劑說明書操作。合成的cDNA置于-20 ℃保存。取 1.5 μL cDNA進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)。再于72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)w=2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后切膠回收。膠回收根據(jù)Qiagen公司的膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 pBABE-hSSB1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建

1)目的基因片段和載體雙酶切：用BamH I、SalI酶分別雙酶切回收的hSSB1目的片段以及載體pBABE，37 ℃酶切30 min。

2)切膠回收：雙酶切后的產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，按試劑說明書操作。

3)目的片段與pBABE表達(dá)載體的連接：將回收的目的基因hSSB1片段以及載體pBABE在T4 DNA 連接酶作用下連接，16 ℃水浴反應(yīng)過夜。

4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 各取5 μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，分別涂布于含氨芐抗性的LB 平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個(gè)培養(yǎng)皿上各挑取3個(gè)單克隆菌落接種于6 mL 含氨芐抗性的LB 培養(yǎng)液中,37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。

5)質(zhì)粒提取與酶切鑒定：按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并分別用BamHI、SalI酶做酶切鑒定，同時(shí)也做PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物行w=1.5％ 瓊脂糖凝膠電泳。

6)測(cè)序鑒定：將酶切及PCR擴(kuò)增鑒定正確的克隆送Invitrogen公司測(cè)序分析。

1.2.5 制備病毒上清液 轉(zhuǎn)染前1 d，10 cm平皿鋪板HEK293T包裝細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到30％～50％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pBABE-vector或pBABE-hSSB1和病毒包裝質(zhì)粒PIK，操作按Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于37 ℃，φ=5％ 的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后，收集病毒上清液，用0.45 μm過濾器過濾病毒上清，-80 ℃保存。

1.2.6 穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 鋪板HeLa和HepG2細(xì)胞于6孔板中，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞密度達(dá)到50％時(shí)開始感染病毒。每孔加入2 mL病毒液(含8 μg/mL polybrene)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后換另外2 mL病毒液繼續(xù)感染細(xì)胞。再過4 h后，棄去病毒液，換正常培養(yǎng)基過夜。感染24 h后，用puromycin(0.8 μg/mL)篩選5 d后，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

1.2.7 Western blotting 檢測(cè) 收集HeLa和HepG2對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，提取蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度并定量,用w=10％ 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜200 mA,2 h,用含w=5％ 脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，孵育hSSB1一抗(1∶2 000)和HSP70(1∶1 000)4 ℃過夜；TBST 洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h；TBST 洗滌同前，X光片壓片，顯影、定影。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因hSSB1的擴(kuò)增

從HeLa細(xì)胞中提取RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后得到其cDNA。以該cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增出目的基因hSSB1和GAPDH基因的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果可見在300 bp左右的條帶(圖1)，為GAPDH的擴(kuò)增條帶，說明所抽提的RNA是完整的。同樣在500～750 bp處也有一特異性擴(kuò)增條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增的hSSB1片段大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定

將PCR擴(kuò)增的目的基因片段用BamHI、SalI雙酶切后與同樣經(jīng)雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro連接,連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑菌，并提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到了約650 bp 的目的片段和約5 100 bp的載體片段(圖2中第2泳道)。同時(shí)將得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到很明顯的目的條帶(圖2中第3泳道)。說明得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒是正確的。

圖1 RT-PCR 擴(kuò)增獲得的hSSB1編碼區(qū)的電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、SalI酶切及PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將酶切和PCR鑒定正確的質(zhì)粒送去Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明克隆的hSSB1片段已成功插入pBABE中的指定位點(diǎn)，而且閱讀框架也正確無(wú)誤,其序列與基因文庫(kù)中完全一致，未見有堿基突變(圖3，框示為hSSB1的起始密碼子)。

2.4 Western blotting 檢測(cè)HeLa和HepG2細(xì)胞中hSSB1的表達(dá)

將包裝好的pBABE-hSSB1和對(duì)照病毒液感染人腫瘤細(xì)胞系HeLa和HepG2細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素(0.8 μg/mL)篩選后,得到了穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株。篩選后的細(xì)胞提取蛋白做Western blotting鑒定。結(jié)果表明：hSSB1轉(zhuǎn)染的HeLa 和HepG2細(xì)胞中均可見到hSSB1特異性條帶,且hSSB1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(圖4)。證實(shí)穩(wěn)定篩選得到的HeLa和HepG2細(xì)胞株中有hSSB1蛋白的持續(xù)高表達(dá)。

圖3 pBABE-hSSB1的測(cè)序結(jié)果：框中所示為hSSB1的起始密碼子

圖4 Western blotting 檢測(cè) hSSB1基因表達(dá)情況

3 討 論

hSSB1是一編碼211個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為33 000 的新蛋白質(zhì)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)hSSB1可以招募MRN復(fù)合物到雙鏈DNA斷裂位點(diǎn)，激活A(yù)TM所依賴性的信號(hào)通路[8]。此外，hSSB1還可以和MRN復(fù)合物中的NBS1直接結(jié)合，從而增強(qiáng)MRN復(fù)合物的核酶內(nèi)切酶活性[9]。運(yùn)用串聯(lián)親和純化的方法篩選出了一個(gè)與hSSB1相互作用的蛋白INTS3，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)INTS3可以通過調(diào)控hSSB1從而參與DNA損傷反應(yīng)[10-13]。因此hSSB1在DNA損傷應(yīng)答中發(fā)揮著重要的功能。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能有效地將外源基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并可以穩(wěn)定表達(dá)外源基因，而且其病毒包裝過程簡(jiǎn)單，因此成為構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)株最常用載體之一。在本實(shí)驗(yàn)中我們將hSSB1基因構(gòu)建在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定以及測(cè)序證實(shí)目的基因hSSB1序列正確，成功構(gòu)建了重組子pBABE-hSSB1。然后將所構(gòu)建的含hSSB1基因的重組質(zhì)粒以及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa和HepG2 細(xì)胞，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro上含有嘌呤霉素抗性基因，加入嘌呤霉素后陽(yáng)性克隆細(xì)胞才會(huì)存活，通過進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。為了鑒定hSSB1基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)染到HeLa和HepG2 細(xì)胞中，我們通過western blot的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和pBABE-hSSB1的細(xì)胞中hSSB1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了hSSB1基因的HeLa和HepG2細(xì)胞中，其hSSB1目的條帶比轉(zhuǎn)染了對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)量均明顯增加，表明hSSB1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)染到HeLa和HepG2 細(xì)胞中并且有此蛋白的過量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建hSSB1高表達(dá)的病毒載體，為今后進(jìn)一步研究hSSB1的生物學(xué)功能奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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