毛黎敏，張 勇，李陽源，黃 海，李 波，李文笙，陳國華，林浩然

(1．海南大學(xué)海洋學(xué)院暨熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實驗室，海南 海口570228；2．中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實驗室∥中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510275)

花鰻鱺Anguillamarmorata屬于鰻鱺目Anguilliformes、鰻鱺科Anguillidae、鰻鱺屬Anguillia，在我國主要分布于海南、福建、廣東、浙江沿海江河，是我國魚類中名貴的經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染、攔河建壩等原因，導(dǎo)致花鰻鱺的自然資源劇減，我國已將其列為二級保護(hù)動物。目前，海南、廣東等地積極發(fā)展花鰻鱺人工養(yǎng)殖業(yè)，市場前景廣闊，產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢頭良好。然而，鰻鱺人工繁育技術(shù)至今尚未解決。花鰻鱺的苗種完全依賴對天然苗種的捕撈，這不僅嚴(yán)重影響了養(yǎng)鰻產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，而且對天然鰻鱺資源的保護(hù)與合理利用造成威脅。因此，開展花鰻鱺人工繁育研究迫在眉睫。

魚類的生殖活動受到腦-腦垂體-性腺軸調(diào)控。下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)刺激腦垂體促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GTH)的合成與釋放。促性腺激素與其受體相結(jié)合后，誘導(dǎo)性腺細(xì)胞產(chǎn)生性類固醇激素，促進(jìn)性腺的發(fā)育與成熟。脊椎動物具有兩種GTH：促濾泡刺激激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)和促黃體生成激素(Luteinizing Hormone,LH)。它們是由異源二聚體組成的糖蛋白激素，由共同的α亞基通過非共價鍵與特異的β亞基相連，即促黃體激素(LH)由GtHα與LHβ組成，促卵泡激素(FSH)由GTHα與FSHβ組成[1]。對日本鰻鱺Anguilla.japonica的研究表明：FSH能誘導(dǎo)未成熟雄性日本鰻鱺雄激素增加，促進(jìn)精巢發(fā)育[2-3]；LH能促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟[4]。因此，我們擬采用基因重組表達(dá)的花鰻鱺促性腺激素來誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育成熟。在克隆出花鰻鱺促性腺激素基因cDNA的基礎(chǔ)上，建立高效表達(dá)花鰻鱺促黃體生成激素(LH)的真核表達(dá)系統(tǒng)體系，表達(dá)出有生物活性的促性腺激素，以期用于花鰻鱺人工誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育成熟等基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA、野生型畢赤酵母菌株X-33均為本實驗室保存。

1.1.2 主要藥品與試劑 限制性內(nèi)切酶XbaI、EcoRI、DraI,Blend Taq酶購自TOYOBO公司；Pfx高保真性酶購自invitrogen公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；Peptone,Yeast Extract為Oxioid LTR.Co.td 產(chǎn)品、YNB為Difco(USA)產(chǎn)品；抗生素Zeocin 購自Invitrogen公司； His-Tag、羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗為博士德生物工程有限公司(武漢)產(chǎn)品；PCR引物合成和DNA測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)用LB低鹽培養(yǎng)基(zeocin終質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL)，酵母培養(yǎng)采用YPD、YPDS(zeocin抗生素質(zhì)量濃度分別為100，200，500 μg/mL)、BMGY、BMMY培養(yǎng)基，配方見invitrogen公司的酵母表達(dá)手冊。

1.2 方法

1.2.1GTHα和LHβ基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)本實驗室所克隆出的GTHα(GenBank序列號：FJ490345)、LHβ(GenBank序列號：FJ490347)分別設(shè)計引物PG1、PG2、PL1、PL2(表1)， 以花鰻鱺腦垂體cDNA為模板，分別擴(kuò)增基因片段GTHα、LHβ。所擴(kuò)增的片段GTHα、LHβ分別經(jīng)膠回收、與pGEM-T載體連接、轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，分別挑取3個陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。測序正確的陽性質(zhì)粒分別命名為T-GTHα、T-LHβ。

1.2.2 pPICZaA-LHβα重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 據(jù)所測質(zhì)粒T-GTHα、T-LHβ的序列設(shè)計引物PG3、PG4、PL3、PL4， PG3引入EcoRI酶切位點(diǎn)；PL4引入XbaΙ酶切位點(diǎn)；PG4、PL3均引入linker(Gly-Ser)×3(引物序列見表1)。第一輪PCR以T-GTHα、T-LHβ質(zhì)粒為模板，引物分別用PG3、PG4，PL3、PL4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的酶用invitrogen公司的Pfx高保真酶，并回收產(chǎn)物；第二輪PCR則以第一輪的產(chǎn)物當(dāng)作第二輪的模板和引物，擴(kuò)增的酶用TOYOBO公司的Blend Taq酶，進(jìn)行擴(kuò)增，回收所需目的大小的條帶。6His標(biāo)簽和終止密碼子均為載體上自帶。

將目的片段與空載體pPICZαA均用EcoRI、XbaI進(jìn)行雙酶切、膠回收，再將酶切回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(構(gòu)建示意圖見圖1)。小量提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定，分別選取3個陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。序列正確的陽性共表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZαA-LHβα。

1.2.3 電轉(zhuǎn)入酵母菌株中 根據(jù)分子克隆實驗指南大量制備和提取質(zhì)粒 pPICZαA-LHβα，并測定pPICZαA-LHβα的濃度。將質(zhì)粒 pPICZαA-LHβα用限制性內(nèi)切酶DraΙ 進(jìn)行線性化、膠回收。

表1 克隆所用引物序列

圖1 pPICZaA-LHβa載體構(gòu)建示意圖

將所線性化的約10 μg共表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA-LHβα電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌株X-33中，并涂布于YPDS平板上(YPDS平板中zeocin抗生素的質(zhì)量濃度分別為100，200，500 μg/mL)，篩選生長表型，該菌命名為pPICZαA-LHβα-X33。

1.2.4 重組菌的發(fā)酵 在高抗生素的YPDS平板上挑取陽性克隆4個，接種于BMGY培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)過夜，直至A600達(dá)到2～6時，離心、去除上清，沉淀加5 mL BMMY溶解，甲醇的終體積分?jǐn)?shù)為0.7％。分別在24，48，72，96 h取樣并補(bǔ)加甲醇，維持甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.7％，于28 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)。同時，做兩個陰性對照，一個挑取YPDS平板上的pPICZαA-LHβα陽性克隆，進(jìn)行培養(yǎng)，但不加甲醇誘導(dǎo)；另一個對照為空載體pPICZαA，進(jìn)行培養(yǎng)，同時甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.7％。每次所取的樣參照TCA蛋白沉淀法沉淀蛋白后，用SDS-PAGE和western blot檢測上清中的表達(dá)產(chǎn)物。Western blot 檢測時，His-Tag 作為一抗，濃度為1∶2 000，室溫、搖床上孵育2 h；二抗用羊抗鼠辣根過氧化物酶作標(biāo)記，濃度為1∶2 000，室溫?fù)u床上孵育1 h，ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 LHβ、GTHα片段的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳顯示，產(chǎn)物GTHα大小296 bp、LHβ大小為348 bp，回收后與pGEM-T載體重組，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析證實：擴(kuò)增片段均與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 pPICZaA-LHβα重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

基因片段GTHα、LHβ經(jīng)搭橋連接成單一片段LHβα成功，其片段大小約為700 bp(見圖2)。重組質(zhì)粒 pPICZαA-LHβα分別經(jīng)EcoRI、XbaI雙酶切鑒定、DNA序列分析與預(yù)期結(jié)果相符，氨基酸序列沒有移碼突變。

圖2 LHβα基因片段驗證圖

2.3 表達(dá)菌株的陽性篩選

pPICZαA-LHβα重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入X-33酵母菌株，并涂布在含有高抗生素Zeocin的YPDS平板上，結(jié)果在質(zhì)量濃度100 μg/mL上約生長出150～200個單菌落、200 g/mL上約生長出40～60個單菌落，而500 μg/mL的平板上則沒有菌落生長。所以在200 μg/mL的平板上挑取陽性菌。

2.4 SDS-PAGE分析和Western blot 檢測目的蛋白

將所搖菌的4個樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳和western blot 檢測，結(jié)果LHβα重組蛋白表達(dá)量以96 h最高，大小約為45 000，抗生素質(zhì)量濃度為200 μg/mL，甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.7％，PH6.0(圖3)。

圖3 LHβα 表達(dá)蛋白檢測圖

3 討 論

在魚類中，對促性腺激素的結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系研究較少[5]。主要是因為很難獲得足夠量的GTHs。其次，LH和FSH具有很多相似的化學(xué)性質(zhì)，所以要分離純化天然的LH和FSH很困難。而重組蛋白的表達(dá)則能較好的解決這一問題，同時重組蛋白的獲得對于抗體的制備、三級結(jié)構(gòu)的研究以及進(jìn)一步研究蛋白的功能等都具有非常重要的意義[6]。促性腺激素是由異源二聚體組成的糖蛋白激素，亞基的分離會影響異源二聚體蛋白的生物活性[5]。同時，促性腺激素α亞基的C-末端和β亞基的N-末端的所形成的區(qū)域利于其與促性腺激素受體結(jié)合[7-8]；而α亞基的N-末端和β亞基的C-末端則不能促進(jìn)其與受體的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9-10]。所以，本文將LHβ亞基與GTHα連接成一個共表達(dá)基因LHβα，N-末端為β亞基，C-末端為α亞基(見圖1)。

本研究在LHβ與GTHα亞基之間，引入了含六個氨基酸的linker，即(Gly-Ser)×3。人絨毛膜促性腺激素(hCG)已經(jīng)在畢赤酵母中成功表達(dá)[11-12]。在hCG中，β亞基的C-末端的最后30個氨基酸包含有C-末端肽(CPT)，它起到一個linker的作用，在異源二聚體的連接上起到至關(guān)重要的作用[13]。在內(nèi)源性的促卵泡激素二聚體蛋白中，只有當(dāng)FSHβ的C末端或GTHα的N末端含有CPT時，才能進(jìn)行正常的合成、分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9,10,13]?；狑~LH缺乏CPT或者CPT類似結(jié)構(gòu)，所以LHβα之間引入(Gly-Ser)×3 的linker。而Gly-Ser重復(fù)序列是帶負(fù)電荷的、具有強(qiáng)親水性，在β與α亞基之間能夠提供足夠的空間供亞基的折疊，形成與內(nèi)源蛋白結(jié)構(gòu)相近的、并能與其受體結(jié)合。兩基因間引入linker的方法在其他共表達(dá)基因中也常用到，如ΙL-3和GM-CSF[14]、特異型抗體與GM-CSF[15]等。

在對日本鰻鱺的研究表明腦垂體合成與分泌的促性腺激素(GTH)在性腺發(fā)育成熟中發(fā)揮主要作用。在養(yǎng)殖條件下，鰻鱺由于缺乏適合的生態(tài)環(huán)境，促性腺釋放激素和促性腺激素未能充分分泌和發(fā)揮作用，使得性腺發(fā)育成熟、排卵、排精等生理過程無法完成。注射魚類腦垂體或hCG已經(jīng)被成功用于誘導(dǎo)日本鰻鱺和歐洲鰻鱺的性腺發(fā)育成熟和產(chǎn)卵，但結(jié)果還不理想，存在親鰻對激素反應(yīng)慢、誘導(dǎo)性腺發(fā)育成熟效應(yīng)差，成熟率、受精率和存活率低，仔魚不能正常發(fā)育等問題[16-18]。這可能和這些異源促性腺激素不能完全代替同源促性腺激素的生理作用，造成性腺發(fā)育與成熟異常有關(guān)。近年來，許多魚類的促性腺激素基因重組已在幾種表達(dá)體系中成功表達(dá)，如大馬哈魚的LH在大腸桿菌中表達(dá)[19]；非洲鯰魚的FSH和LH在變形蟲表達(dá)[20]；日本鰻鱺的FSH[4]和羅非魚的LH[21]在酵母中表達(dá)；鯉魚的GTH-α亞基[22]、鯰魚FSH和LH[23]在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)；斑紋鱸的FSH和LH[24]、東北鮭魚LH[25]在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)；金魚的FSH、LH在虹鱒胚胎細(xì)胞與家蠶幼蟲中表達(dá)[26]；斜帶石斑魚的FSH和LH[27]在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并研究發(fā)現(xiàn)重組促性腺激素，可以刺激石斑魚性類固醇激素的分泌，進(jìn)而促進(jìn)性腺發(fā)育與成熟。因此，獲得重組促性腺激素，以誘導(dǎo)鰻魚性腺發(fā)育成熟與產(chǎn)卵是解決鰻鱺人工繁殖的關(guān)鍵之一。

然而，不管是昆蟲表達(dá)還是哺乳動物表達(dá)體系表達(dá)重組蛋白，存在耗費(fèi)大、實驗操作難、很難大規(guī)模的擴(kuò)大培養(yǎng)，不利于純化。而用甲醇誘導(dǎo)的酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，不需要耗費(fèi)特殊昂貴的儀器、操作簡便、同時能夠大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)。其次，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)修飾功能，如二硫鍵的形成、糖鏈的加工，對重組表達(dá)蛋白的N端進(jìn)行糖基化。N-連接糖基位點(diǎn)在GTH的功能活性非常重要，特別是在糖蛋白激素與受體結(jié)合后激活G蛋白和刺激二級信號方面特別重要[28]。再次，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)將外源基因表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外，從而利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。而外源蛋白需要分泌到細(xì)胞外，則需要在選擇添加前導(dǎo)肽。當(dāng)產(chǎn)物濃度高可能會引發(fā)一些自身的調(diào)節(jié)抑制表達(dá)[29]，同時胞外分泌表達(dá)也可以減少下游的純化工序。但胞外表達(dá)是需要在載體中使用信號肽，而畢赤酵母的表達(dá)載體中不僅含有強(qiáng)啟動子-乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子,能夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)，同時AOX1啟動子與多克隆位點(diǎn)之間含有一段α信號肽，所以表達(dá)外源基因時可以不需要另外添加信號肽，直接添加編碼成熟肽的堿基序列，從而使表達(dá)系統(tǒng)更加簡單、高效。

所以本研究選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組花鰻鱺促黃體激素，且已經(jīng)成功表達(dá)，將可以進(jìn)行下一步功能、抗體等方面的研究，不僅充實花鰻鱺生殖內(nèi)分泌學(xué)，而且可為花鰻鱺及其他鰻鱺人工繁育打下堅實基礎(chǔ)。

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