李 強(qiáng)，李 揮，龐 坤，俞 婧，夏 靜

（河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091）

維生素是人和動物為維持正常生理功能而必需從外界食物中獲取的一類微量有機(jī)物質(zhì)，分為脂溶性和水溶性兩類。功能性飲料是通過調(diào)整飲料中天然營養(yǎng)素的成分和含量比例以適應(yīng)某些特殊人群營養(yǎng)需求的飲品，其中多添加各種水溶性維生素，主要包括有：維生素B1、維生素B2、吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇、泛酸、煙酸、煙酰胺、生物素、葉酸、維生素B12［1－2］。目前國家標(biāo)準(zhǔn)（GB／T5009）中只規(guī)定了其中幾種維生素的單項(xiàng)單次檢測方法［3］，由于水溶性維生素多以離子形態(tài)存在于水溶液中，多采用的離子對試劑作為流動相這樣會在不同程度對色譜柱及泵造成破壞［4］。且大多數(shù)報道中［5－8］只針對5～8種維生素進(jìn)行研究，且報道中由于樣品的不同，實(shí)驗(yàn)的具體步驟和分離效果也有很大的不同［9－10］。

目前對水溶性維生素檢測方法的研究主要有微生物法、熒光光度法、HPLC法及HPLC－MS／MS法［11］。其中HPLC法及HPLC－MS／MS法具有一定的優(yōu)越性，且已成為維生素分析的主流方法。但考慮到HPLC法更具有普遍性和便捷性，本研究采用HPLC法進(jìn)行試驗(yàn)，此外考慮對色譜柱的保護(hù)，未使用離子對試劑為流動相，而采用甲醇和磷酸二氫鉀進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合DAD檢測器和熒光檢測器進(jìn)行測定。該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，應(yīng)用于大規(guī)模的產(chǎn)品檢測具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素B1、維生素B2、吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇、泛酸、煙酸、煙酰胺、生物素、葉酸、維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度＞99%）；甲醇，乙醇為色譜純；其余所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水機(jī)制得。

液相色譜儀（美國，Aglient 1200）、固相萃取裝置（美國安捷倫公司）；AS超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；RT15T高速冷凍離心機(jī)（上海天美公司）；AE 200分析天平（法國Mettler公司）；氮吹儀（Organomation Associates，Jnc.）；渦流振蕩器（德國IKA公司）；C18固相萃取柱（60mg／3ml，美國安捷倫公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18反相色譜柱（150×4.6μm，5μm）；流動相：甲醇和0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：0.6mL／min；

二極管陣列檢測器檢測波長：維生素B1（280nm）、泛酸（210nm）、煙酸（261nm）、煙酰胺（261nm）、生物素（210nm）、葉酸（362nm）、維生素B12（261nm）；

熒光檢測器檢測波長：維生素B2（λex＝462nm，λem＝522nm）、吡哆胺（λex＝293nm，λem＝355nm）、吡哆醛（λex＝293nm，λem＝355nm）、吡哆醇（λex＝293nm，λem＝355nm）、進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃；運(yùn)行時間：30min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

維生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：維生素B1、吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇、泛酸、煙酸、煙酰胺、維生素B12、生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1g／L，0.01mol／L HCl）；維生素 B2（0.1g／L，以少量氨水溶解后用水定容）；葉酸（1g／L，以少量稀KOH溶解后，用0.01mol／L HCl定容）。貯備液于4℃冰箱保存，將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，需臨用現(xiàn)配。

1.2.3 樣品處理

為去除飲料中干擾成分，采用固相萃取來進(jìn)行提取和凈化，取5mL樣品加入20mL磷酸溶液，超聲振蕩5min后，加入活化好的固相萃取小柱，離心后依次用pH4.2的水和10mL甲醇洗脫溶出。溶出液氮?dú)獯蹈珊笕芙獠⒍ㄈ葜?mL流動相中，過膜備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 測定波長的選擇

對11種水溶性維生素分別在190nm～600nm做紫外光譜掃描，得到各物質(zhì)的最大吸收波長：維生素B1（265nm）、維生素 B2（375nm）、吡哆胺（261nm）、吡哆醛（261nm）、吡哆醇（261nm）、泛酸（200nm）、煙酸（261nm）、煙酰胺（261nm）、生物素（200nm）、葉酸（280nm）、維生素B12（261nm）；分別對維生素B2、吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用λex＝280nm，λem＝380nm；λex＝293nm，λem＝395nm；λex＝320nm，λem＝410nm；λex＝462nm，λem＝522nm條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明λex＝462nm，λem＝522nm是維生素B2的最佳測定條件；λex＝293nm，λem＝395nm是吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇的最佳測定條件。結(jié)合上述條件，最終選定1.2.1中的波長做為測定波長。另外為實(shí)現(xiàn)11種維生素的同步測定，在設(shè)定洗脫程序中加入熒光檢測器在15min時由λex＝293nm，λem＝395nm切換為λex＝462nm，λem＝522nm。分離色譜圖見圖1，圖2。

圖1 梯度洗脫DAD檢測210nm時各種維生素的分離色譜圖

圖2 梯度洗脫熒光檢測各維生素的分離色譜圖

2.1.2 流動相選擇

分離水溶性維生素多用到辛烷磺酸鈉等離子對試劑進(jìn)行洗脫分離，但離子對實(shí)際會在一定程度上破壞色譜柱并縮短壽命，因此本實(shí)驗(yàn)采用了磷酸鹽水溶液（0.05mol／L）和甲醇，結(jié)合梯度洗脫。當(dāng)甲醇比例超過5%時，維生素B5、煙酰胺、煙酸、維生素B1、葉酸會很快流出且峰形重疊，同時甲醇低于40%維生素B2的出峰時間大于30min，因此采用梯度洗脫。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的洗脫程序中0～10min時A∶B＝4∶96可使吡哆胺、煙酸、維生素B1、吡哆醛、吡哆醇、煙酰胺得到很好的分離；20～25min時A∶B＝40∶60時泛酸、葉酸、維生素B12、生物素、維生素B2進(jìn)行分離，獲得了良好的分離效果。

表1 分離11種水溶性維生素較佳分離洗脫程序

2.2 線性范圍和檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），求得回歸方程，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2可以看出，11種維生素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表2 11種水溶性維生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)

對已知濃度的飲料樣品進(jìn)行三個水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每個水平重復(fù)5次。其平均回收率和RSD值結(jié)果見表3所示。表3數(shù)據(jù)表明，11種水溶性維生素的回收率為93%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.3%～3.7%，本方法的回收率與精密度均能滿足要求。

2.4 幾種飲料的測定結(jié)果

運(yùn)用本方法對市場上購買的3種品牌飲料進(jìn)行了檢測，測定結(jié)果見表4。可見其維生素實(shí)際含量與產(chǎn)品標(biāo)注值的相符程度，本方法重復(fù)性、靈敏度和準(zhǔn)確性都比較滿意，操作簡便，可滿足功能飲料中水溶性維生素日常檢驗(yàn)的需要。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

表4 實(shí)際樣品測定結(jié)果 （單位：mg／L）

3 結(jié)論

建立了功能性飲料中同時測定11種水溶性維生素的高效液相色譜法。此方法樣品處理簡單，分離度好，提高了檢測的效率，且準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有一定應(yīng)用于大規(guī)模檢測的實(shí)際意義。

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