刁志虹，高 毅，李 威

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050011；2.河北省中醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050017）

活血化瘀補腎壯骨中藥促進(jìn)BMP基因克隆轉(zhuǎn)染犬牙髓細(xì)胞增殖的實驗研究

刁志虹1，高 毅2*，李 威2

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050011；2.河北省中醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050017）

目的觀察活血化瘀補腎壯骨含藥血清對骨形成蛋白2（bonemorphogenetic proteins 2，BMP2）綠色熒光融合蛋白（green-fluorescent protein，GFP）真核表達(dá)質(zhì)粒（pEGFP-N1-BMP2）在體外轉(zhuǎn)染的犬牙髓細(xì)胞（dog dental pulp cells，DDPCs）增殖情況的影響，探討活血化瘀補腎壯骨中藥在牙本質(zhì)改建形成中的作用機制。方法將BMP2-DDPCs分別于活血化瘀補腎壯骨含藥血清組（A組）、無藥血清組（B組）和胎牛血清組（C組）中培養(yǎng)。分別于24、48、72h用溴化-3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑［3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］法檢測BMP2-DDPCs增殖活性。結(jié)果BMP2-DDPCs分別在A、B、C 3組中培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)相同。3組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，A組增加更為顯著，與其他2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論活血化瘀補腎壯骨中藥含藥血清作用于BMP2-DDPCs，促進(jìn)了該細(xì)胞增殖活性，血化瘀補腎壯骨中藥含藥血清大大增加了組織工程重要環(huán)節(jié)的種子細(xì)胞的數(shù)量。

細(xì)胞增殖；活血祛瘀劑；中草藥

保存牙髓活力是臨床治療牙體、牙髓疾病的一項基本原則，牙本質(zhì)的修復(fù)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是一個前沿課題。中醫(yī)中藥在促進(jìn)新骨形成、骨愈合方面積累了大量經(jīng)驗。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為牙本質(zhì)的修復(fù)提供了一種理想的治療方法，而作為組織工程中重要環(huán)節(jié)的種子細(xì)胞數(shù)量的多少是影響牙本質(zhì)修復(fù)效果的重要因素。本實驗應(yīng)用活血化瘀補腎壯骨含藥血清作用于骨形成蛋白2（bone morphogenetic proteins 2，BMP2）綠色熒光融合蛋白（greenfluorescent protein，GFP）真核表達(dá)質(zhì)粒（pEGFPN1-BMP2）在體外轉(zhuǎn)染的犬牙髓細(xì)胞（dog dental pulp cells，DDPCs）觀察中藥對BMP2-DDPCs增殖的影響，探討活血化瘀補腎壯骨中藥在牙本質(zhì)改建形成中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 種子細(xì)胞BMP2-DDPCs的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染：見參考文獻(xiàn)［1］。

1.2 藥劑制備：中藥土鱉蟲、自然銅、血竭、醋制乳香、續(xù)斷、杜仲、骨碎補、桑寄生、川芎、杭白芍、炙甘草河北醫(yī)科大學(xué)生化教研室提供。按5.0g生藥/kg體質(zhì)量計算用藥量。除血竭以外的藥物加10倍量水煎煮1.5h，過濾；加同量蒸餾水重煎1.5h，過濾。合并濾液濃縮至150mL，裝袋備用。

1.3 實驗分組：實驗分為含藥血清組（A組）、無藥血清組（B組）和胎牛血清組（C組）。A組血清來自2只健康犬，按體表面積的方法折算人體等效劑量，連續(xù)7d喂藥后，最后1d間隔2h再次給藥，于末次給藥后1h股動脈采血，離心3 000r/min，20min，取上清，濾菌器（Biotech，0.20μm）抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。B組該組血清來自2只健康犬，給予等劑量生理鹽水連續(xù)7d喂服，最后1d間隔2h再次給予生理鹽水，于末次給予生理鹽水后1h股動脈采血，離心3 000r/min，20min，取上清，抽濾除菌后分裝，-20℃條件下保存?zhèn)溆?。C組血清購買于杭州四季青生物工程有限公司。

1.4 BMP2-DDPCs增殖活動檢測：采用溴化-3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑［3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］法檢測活血化瘀補腎壯骨方劑對BMP2-DDPCs生長和增殖情況的影響。將BMP2-DDPCs細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、顯微鏡下計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，根據(jù)實驗設(shè)計將培養(yǎng)液置換成3種血清繼續(xù)培養(yǎng)，每組6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72h，各孔中加入5g/LMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出上清，每孔中加入100μL二甲基亞砜搖床振蕩15min使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫測試儀測定490nm的每孔細(xì)胞吸光度（OD值）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

BMP2-DDPCs分別在A、B、C 3組中培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)相同；3組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，A組增加更為顯著，與其他2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 BMP2-DDPCs分別在A、B、C 3組中培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況比較Table 1 Comparison of BMP2-DDPCs proliferation in Chinese tradition medicine serum，non-medicine serum and the bovine serum

3 討 論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為先天之本，主骨生髓，骨的生長、發(fā)育與腎精盛衰休戚相關(guān)。國內(nèi)學(xué)者［2-5］發(fā)現(xiàn)補腎中藥能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。本研究選用補腎壯骨中藥，其中骨碎補、續(xù)斷、桑寄生的作用為滋養(yǎng)肝腎、強筋健骨、促進(jìn)骨愈合、促進(jìn)骨基質(zhì)鈣化，另外骨碎補可明顯增加成骨細(xì)胞活性。土鱉蟲、血竭、醋制乳香、白芍、杜仲具有調(diào)氣活血、散瘀止痛的作用。自然銅性平、味辛，具有散瘀止痛的作用，可明顯促進(jìn)骨愈合。在臨床上諸藥合用可以達(dá)到促進(jìn)新骨形成的目的。

Yang等［6］證實BMP2具有誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的能力，進(jìn)而促進(jìn)成牙本質(zhì)的作用。然而外源性BMP2在體內(nèi)的生物活性低，吸收較快，易降解，不能長久穩(wěn)定地發(fā)揮誘導(dǎo)作用［7］，而基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能使細(xì)胞在相對長的時間內(nèi)表達(dá)需要的目的基因，在局部長期穩(wěn)定的釋放細(xì)胞生長因子。

pEGFP-N1-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的DDPCs能夠表達(dá)BMP2基因，BMP2蛋白表達(dá)呈陽性，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染促使DDPCs分泌BMP2蛋白，進(jìn)而參與誘導(dǎo)成牙本質(zhì)作用［8］。轉(zhuǎn)染BMP2基因可提高DDPCs的堿性磷酸酶活性且明顯高于對照組，提示BMP2基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)了DDPCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞表型分化［9］。BMP2-DDPCs超微結(jié)構(gòu)與成牙本質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特征相符，符合成牙本質(zhì)細(xì)胞的表型，而且pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)染前后DDPCs增殖情況沒有明顯的改變［10］。掃描電鏡觀察異種燒結(jié)骨上細(xì)胞黏附、生長的情況，可見支架材料的孔徑為100～600μm，材料表面粗糙，利于細(xì)胞的黏附生長，孔隙中可見BMP2-DDPCs貼附于材料上，生長旺盛，伸展良好［1］。

本實驗結(jié)果顯示，BMP2-DDPCs分別在含藥血清、無藥血清和牛血清組中培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)相同；3組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，含藥血清組增加更為顯著。說明補腎壯骨中藥含藥血清作用于BMP2-DDPCs，可以促進(jìn)該細(xì)胞增殖，大大增加了組織工程重要環(huán)節(jié)的種子細(xì)胞的數(shù)量。本研究為pEGFP-N1-BMP2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的牙髓成纖維細(xì)胞經(jīng)中藥增殖后與異種燒結(jié)骨復(fù)合作為新型有效的蓋髓劑應(yīng)用于臨床提供了實驗基礎(chǔ)。

［1］ 馮艷紅，刁志虹，高毅，等.BMP2基因轉(zhuǎn)染犬牙髓成纖維細(xì)胞與異種燒結(jié)骨復(fù)合組織工程的實驗研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32（8）：908-912.

［2］ 邵敏，趙靜，王斌.不同中藥含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞影響的實驗研究［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14（5）：19-21.

［3］ 任貴云，趙虎，董福生，等.活血化瘀補腎壯骨中藥促進(jìn)山羊下頜骨牽張成骨的實驗研究［J］.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（3）：319-322.

［4］ 董?；?，鄭軍.骨碎補對骨愈合過程中相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23（7）：518-521.

［5］ 閆寶勇，董福生，董玉英，等.補腎壯骨中藥對成骨細(xì)胞OPG、RANKLmRNA表達(dá)的影響［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，25（3）：194-198.

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［7］ FRANCESCHI RT，WANG D，KREBSBACH PH，et al.Gene therapy forbone formation：in vitro and in vivo osteogenic activity of adenovirusexpressing BMPT［J］.J Cell Biochem，2000，78（3）：476-478.

［8］ 馮艷紅，刁志虹，高毅，等.BMP2基因轉(zhuǎn)染犬牙髓細(xì)胞的實驗研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32（9）：1079-1082.

［9］ 刁志虹，高毅，馮艷紅，等.骨形成蛋白2基因轉(zhuǎn)染對犬牙髓細(xì)胞生物學(xué)特性的影響［J］.河北醫(yī)藥，2011，33（24）：3688-3691.

［10］ 馮艷紅，刁志虹，高毅，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染犬牙髓細(xì)胞［J］.中國組織工程研究，2012，16（2）：206-210.

（本文編輯：劉斯靜）

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

THE EXPERIMENTAL STUDY ON THE PROMOTIVE EFFECT OF CHINESE TRADITION MEDICINE ON PROLIFERATION OF DOG DENTAL PULP CELLS TRANSFECTED BY BMP2 GENE

DIAO Zhihong1，GAO Yi2*，LIWei2
（1.Department of Stomatology，the First Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；
2.Department of Stomatology，Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effect of Chinese tradition medicine serum on the proliferation of dog dental pulp cells（DDPCs）transfected with pEGFP-N1-BMP2 eukaryotic expression plasmid in vitro.To investigate the mechanism of Chinese tradition medicine on formation of dentin. M ethods BMP2-DDPCs were cultivated respectively in Chinese tradition medicine serum group（group A），non-medicine serum group（group B）and fetal bovine serum group（group C）.The proliferation activity of BMP2-DDPCswas detected respectively by the 3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT）after 24 hours，48 hoursand 72hours.ResultsAfter BMP2-DDPCs were cultivated in three kinds of serum，there were no differences in the cellsmorphology，but there were differences in the number of the cells.With the prolongation of culture time，the number of the cells gradually increased in the 3 groups，among which medicine serum group increased more prominently. There were significant differences between Chinese traditionalmedicine serum group and the other two groups（P＜0.05）.ConclusionThe Chinese tradition medicine could promote proliferation of BMP2-DDPCs and obviously increase the quantity of seed cells in dentin tissue engineering.

cell proliferation；BLOOD ACT STASISREMOV AGENTS；drug，Chinese herbal

R282

A

1007-3205（2012）08-0911-03

2012-02-18；

2012-05-28

河北省科技廳科學(xué)技術(shù)支撐計劃項目（09276102D-15）

刁志虹（1966-），男，山東黃縣人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事口腔科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：DZH666888@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.015