陶紹能，周建國，程光華，楊繼文，葛俊亮

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241001)

氧穩(wěn)態(tài)的維持是細胞生命活動的基本前提，二氯化鈷常應(yīng)用于體外模擬細胞低氧環(huán)境，這與二價鈷離子可誘導(dǎo)細胞中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia induced factor，HIF-1)及其調(diào)控基因的表達有關(guān)。HIF-1的活性主要由HIF-1α的活性所決定，是最重要的低氧信號轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［1］。在實體瘤的發(fā)展過程中，由于存在血管功能受損和血供障礙的問題，因此缺氧是無法回避的問題，缺氧的嚴重程度決定了腫瘤細胞是適應(yīng)環(huán)境還是走向凋亡［2］。激活的HIF-1α可以影響下游基因的表達，從而影響腫瘤細胞的增殖。本研究從二氯化鈷所致的缺氧誘導(dǎo)肺腺癌A549細胞凋亡和增殖的角度，初步探討HIF-1α在缺氧環(huán)境下的表達及其與細胞凋亡和增殖的關(guān)系。

1 材料和方法

1. 1 材料與試劑 肺腺癌A549細胞株培養(yǎng)于RPMI 1640中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞實驗。新生牛血清(GIBCO，USA);RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA);CoCl2(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，DMS0(Amresco)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Amresco)，Annexin V-FITC/PI雙標記染色試劑盒(晶美公司)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(英國Galaxy)，RT-PCR 試劑盒(invotrigen)，RT-PCR 儀(美國 BIO-RAD Mycycler)，凝膠成像系統(tǒng)為國產(chǎn)Tanon天能。美國BD FACSCantoII流式細胞儀。

1.2 細胞培養(yǎng)和傳代 A549細胞于37℃、5%CO2混合氣體和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，生長培養(yǎng)基為 RPMI 1640完全培養(yǎng)基，含10%熱滅活(56℃，30 min)的小牛血清、青霉素100 U、鏈霉素100 U，待細胞生長呈單層鋪滿瓶底時，用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA為1∶1的混合消化液消化傳代。

1.3 細胞體外乏氧微環(huán)境的建立 將適量化學(xué)乏氧劑CoCl2溶于新鮮三蒸水，配制兩種濃度的工作液，分別適用于96孔培養(yǎng)板和75 cm2培養(yǎng)瓶，分裝入小玻瓶，高壓蒸氣滅菌，4℃冰箱保存。用于模擬腫瘤乏氧微環(huán)境。

1.4 MTT法檢測A549細胞增殖 取對數(shù)生長期的A549細胞制成2×104個/ml細胞懸液，按每孔100μl細胞懸液接種96孔培養(yǎng)板中，每孔剩余的100μl空間用(100－n)μl補足，n為此孔之后加藥量的μl數(shù)。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h(細胞基本貼壁)后加入CoCl2工作液使終濃度為200 μmol/L，分別于 0、4、12、24、48 h 后終止。每一濃度設(shè)3個復(fù)孔，以不含CoCl2的RPMI 1640培養(yǎng)基細胞作為陰性對照，空白孔調(diào)零。繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后終止。每個待測孔加MTT(10 mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后小心吸棄上清液，每孔加DMSO 100 μl，振蕩10 min，酶標儀測定570/620 nm處吸光度(OD)值。根據(jù)OD值繪制細胞生長曲線，分別觀察CoCl2作用不同時間對A549細胞生長的影響。

1.5 半定量RT-PCR檢測HIF-1α mRNA的表達A549細胞按1×106個/瓶接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，孵育12 h待細胞貼壁后加CoCl2使其終濃度為200 μmol/L，隨后在CoCl2200μmol/L濃度的基礎(chǔ)上，選取0、4、12、24和48 h進行觀測。在指定的時間收集細胞用Trizol提取總RNA，用紫外分光光度計測定RNA純度(A260/A280＞1.60)，同時進行 RNA定量。取2μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶在下列條件下合成cDNA:70℃，5 min，42℃延伸 60 min，95℃酶滅活 3 min，4℃終止反應(yīng)。然后用該cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)，PCR引物由Invitrogen公司合成。內(nèi)對照β肌動蛋白(β-actin)引物序列:上游引物:5'-GTGGACATCCGCAAAGACCT-3'。 下游引物:5'-CGAAAGCAATGCTATCACCTC-3'，擴增646 bp;人缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)引物(參照 Genbank:U22431)，上游引物:5'-TGTGAGTTCGCATCTTGATA-3'，下游引物:5'-TTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3'。擴增片段為350 bp，擴增條件如下:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s、52.5℃退火 45 s、72℃延伸 60 s進行相應(yīng)循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。

1.6 AnnexinV-FITC/PI雙標記染色檢測 A549細胞凋亡 采用Annexinv-FITC/PI雙標記染色，流式細胞術(shù)檢測以鑒別腫瘤樣本中的活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。根據(jù)FITC/PI熒光作雙數(shù)散點圖，可獲得由四個象限組成的雙參數(shù)圖。左下象限(left lower quadrant，LLQ)為活細胞，AnexinV-FITC(－)/PI(－);右下象限(right low quadrant，RLQ)為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(－);右上象限(right upper quadrant，RUQ)為晚期凋亡細胞和壞死細胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(+);左上象限(left upper quadrant，LUQ)為細胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細胞，AnnexV-FITC(－)/PI(+)。每個象限的細胞數(shù)就是其受檢總細胞數(shù)中所占的比例。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對A549細胞增殖的抑制作用(見圖1)相同濃度CoCl2(200μmol/L)不同的作用時間，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.782，P＜0.01)，隨著作用時間的延長，細胞抑制越明顯，呈現(xiàn)明顯的時效關(guān)系。從MTT的研究結(jié)果顯示CoCl2對A549細胞的生長曲線與缺氧時間有負相關(guān)性(r=－0.790，P＜0.05)。說明同一濃度CoCl2隨著作用時間的延長可明顯抑制A549細胞增殖，表現(xiàn)出時間依賴性。

圖1 200μmol/L CoCl2作用A549細胞不同時間對細胞生長的抑制作用

2.2 半定量RT-PCR檢測HIF-1αmRNA的表達RT-PCR結(jié)果顯示，未經(jīng)CoCl2處理的A549細胞中HIF-1αmRNA水平很低，在200μmol/L CoCl2的作用下，隨著CoCl2作用時間的延長，HIF-1αmRNA的表達量有不同程度的上調(diào)(F=195.414，P＜0.01。見圖2)。CoCl2與 HIF-1αmRNA表達間表現(xiàn)出較好的時間依賴性(r=0.933，P＜0.05)。

2.3 流式細胞儀對A549細胞凋亡的檢測 Annexin V和碘化丙啶染色后，正常的活細胞不被Annexin V和碘化丙啶染色;凋亡早期的細胞僅被Annexin V染色，碘化丙啶染色呈陰性;壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V和碘化丙啶染色。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示，常氧組細胞以正?；罴毎佣?，凋亡早期和凋亡晚期的細胞比率都很小;乏氧處理后，隨著時間的延長，凋亡早期和凋亡晚期的細胞比率逐漸增加。正常對照組、4、12、24、48 h 組細胞凋亡率分別為(0.60 ±0.10)%、(1.10 ± 0.10)%、(8.63 ± 0.75)%、(12.80 ±0.85)%和(19.33 ±0.80)%(見圖 3)。經(jīng)統(tǒng)計，除正常對照組與4 h組無統(tǒng)計學(xué)意義外(P=0.351)，其他各組均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=484.955，P＜0.01)。

圖2 RT-PCR檢測200μmol/L CoCl2處理A549細胞后不同時間HIF-1αmRNA的表達

圖3 200μmol/L CoCl2處理A549細胞后不同時間細胞凋亡變化

3 討論

實驗性缺氧方法有兩種，一種是在低氧環(huán)境中培養(yǎng)實驗細胞或組織，也稱為環(huán)境缺氧;另一種是在細胞或組織培養(yǎng)液中加入鐵的螯合劑或CoCl2，阻斷氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞中模擬低氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也稱為細胞缺氧。環(huán)境缺氧方法由于需要特殊的培養(yǎng)設(shè)備和低氧濃度的混合氣體，限制了其在實驗中的應(yīng)用。Co2+是鐵螯合酶的底物，可替代氧感受器血紅素中的Fe2+，在高濃度時與氧結(jié)合，將此分子鎖定在脫氧合狀態(tài)，使細胞在不缺氧的環(huán)境下“感覺”缺氧，并上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子的表達而增強細胞的抗缺氧潛力［3］。因此，CoCl2是一種比較好的化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑［4］，本研究中運用 CoCl2誘導(dǎo) A549細胞缺氧。

低氧在惡性腫瘤包括肺癌的生長過程中是普遍存在的。肺癌的這種特殊微環(huán)境可以誘導(dǎo)多種基因表達發(fā)生改變，從而使腫瘤耐受放化療，影響腫瘤的預(yù)后。HIF-1α是低氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，既往文獻［5］提示，HIF-1α與低氧狀態(tài)下細胞增殖有關(guān)。本研究采用MTT法測定A549細胞的生長曲線，結(jié)果表明隨著CoCl2作用時間延長，低氧對A549細胞的增殖隨CoCl2的作用時間延長而增強，表現(xiàn)出一定的細胞毒性，此源于一種對應(yīng)激反應(yīng)的激活。模擬低氧的直接表現(xiàn)是HIF-1α的蓄積增加，本研究對人A549細胞在乏氧條件下HIF-1αmRNA表達進行了研究，我們觀察到，CoCl2作用時間與HIF-1αmRNA的水平上調(diào)具有時間相關(guān)性。隨著CoCl2作用時間延長，HIF-1α mRNA水平明顯增加。

本研究應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測A549細胞經(jīng)低氧培養(yǎng)后的凋亡率，發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境可誘導(dǎo)A549細胞的凋亡，且凋亡率隨CoCl2的作用時間延長而增加，說明乏氧微環(huán)境的確在一定程度上可誘導(dǎo)細胞凋亡。但是有文獻報道［6－7］，不同細胞在不同的實驗條件下，HIF-1α表現(xiàn)出抗凋亡或凋亡作用，尤其是在嚴重或長時間低氧下，HIF-1α可誘導(dǎo)促凋亡基因的表達［8］。目前已知至少有2種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與CoCl2誘導(dǎo)缺氧引發(fā)細胞凋亡有關(guān):①通過細胞表面死亡受體通路［9］，如Fas、TNF-a介導(dǎo)的細胞凋亡;②線粒體通路［10］，并伴隨Bcl-2家族成員表達而改變，其中促進細胞凋亡的蛋白有Bax、Bcl-xs等，抑制細胞凋亡的蛋白有Bcl-2、Bcl-xL等。本研究已經(jīng)證明缺氧可以誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡，但對缺氧誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡的感受通路以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等有待進一步研究。

總之，CoCl2化學(xué)模擬低氧過程中伴隨著對細胞增殖和凋亡的復(fù)雜影響，實際上化學(xué)性模擬低氧也僅僅是部分的與生理性低氧相吻合。本研究提示，在模擬低氧時CoCl2的作用時間應(yīng)引起高度重視，CoCl2對A549細胞具有上調(diào)HIF-1αmRNA表達作用，可抑制細胞的增殖和一定的凋亡誘導(dǎo)作用，這些說明HIF-1α可能在肺癌的發(fā)展中扮演著重要的作用。

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