廖玨 董雯

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物中心，四川 瀘州 646000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，河北 廊坊 065001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是老年性癡呆的一種，多發(fā)生于中年或老年的早期，其發(fā)病率隨年齡增長不斷增高。目前，全球人口漸趨老齡化，AD的發(fā)病率將逐漸增高。AD涉及老年人的健康問題，帶來嚴峻的社會問題和經(jīng)濟問題。因此，提高對AD的認識、重視，減少其發(fā)病，已迫在眉睫。關(guān)于AD其發(fā)病機制尚未明確，有文獻報道［1－2］：AD患者膽堿能神經(jīng)受到損傷和細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)。

多奈哌齊是近年來應(yīng)用于臨床的一種新型可逆性膽堿酯酶抑制劑，而維拉帕米是一種作用于慢通道的鈣離子拮抗劑。本實驗通過Aβ1－40右側(cè)海馬區(qū)立體定向微量注射法制備大鼠AD模型，用多奈哌齊與維拉帕米進行干預(yù)，觀察藥物對AD模型大鼠記憶障礙、大鼠海馬系數(shù)比以及海馬的AChE活性，并行尼氏染色光鏡觀察海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

腦立體定位儀及定位圖譜（美國 Myneurolab公司）；顱骨鉆；微量進樣器；722分光光度計；Aβ1－40（美國Sigma公司），無菌生理鹽水配置成2g·L－1溶液，置于37℃溫箱中孵育1w，使其變?yōu)榫哂猩窠?jīng)毒性的凝聚狀態(tài)；多奈哌齊和維拉帕米由中國藥品生物制品檢定所提供；AChE測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 實驗動物與分組

清潔級健康成年雄性SD大鼠（重慶滕鑫生物科技有限公司）40只，體重250±30g。隨機分成4組，每組l0只，即假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組。

1.2 方法

1.2.1 AD大鼠模型的建立

參照《大鼠腦立體定位圖譜》［3］，選擇右側(cè)海馬區(qū)（前囟向后3.5mm，中線右旁2.8mm，硬腦膜下2.5mm）為注射靶區(qū)。用骨鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用10μ1微量進樣器自腦表面垂直進針2.5mm，以0.5μ1·min－1的速度均勻注入 Aβ1－40溶液5μ1，10min注射畢后，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口，于縫合處予滴0.1ml慶大霉素注射液，并用4萬U青霉素肌肉注射以抗感染，保暖至清醒，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組以等量無菌生理鹽水代替Aβ1－40溶液，其余操作同上。所有操作均在相對無菌條件下進行。

1.2.2 給藥方法

假手術(shù)組、模型組：將蒸餾水按照大鼠體重8ml·kg－1灌胃，1 次 ·d－1；多 奈 哌 齊 組：大 鼠 多 奈 哌 齊 劑 量0.525mg·kg－1。將 制 備 的 多 奈 哌 齊 溶 液 給 予 一 次8ml·kg－1灌胃，1次·d－1；聯(lián)合用藥組：大鼠多奈哌齊劑量0.525mg·kg－1，維拉帕米劑量3mg·kg－1。將制備的多奈哌齊溶液和維拉帕米溶液混合給予一次8ml·kg－1灌胃，1次·d－1；每天上午10時灌胃給藥，持續(xù)4w。

1.2.3 Morris水迷宮實驗

灌胃4w后，采用Morris水迷宮對所有大鼠進行行為認知測試。在整個實驗中保持操作者位置及周圍環(huán)境的相對穩(wěn)定。固定時問為每日9：00～16：00進行。Morris水迷宮［4］主要由圓形水池和自動錄像及分析系統(tǒng)組成。定位航行試驗：歷時5 d，每日分上、下午兩個時段，每個時段分別從4個不同的入水點，將大鼠面向池壁放人水中，記錄2min內(nèi)尋找平臺所需總游泳路程（即逃避潛伏游程）。若大鼠人水后2min內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留l0s。每次訓(xùn)練問隔60s。

1.2.4 海馬系數(shù)測定

行為學(xué)測試結(jié)束后，每只動物稱重并處死，于冰浴中迅速取出腦組織，剝離出大腦皮層和海馬組織，并精確稱量海馬濕重。同時按照下列公式計算海馬系數(shù)：海馬系數(shù)（%）＝海馬濕重（g）／體重（g）×100%。

1.2.5 海馬組織中AChE活性的測定

乙酰膽堿酯酶（AChE）水解乙酰膽堿（ACh）生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應(yīng)生成TNB（對稱三硝基苯，Sym－Trinitrobenzene）黃色化合物，根據(jù)顏色的深淺進行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反映膽堿酯酶的活力。取10%組織勻漿40μl，按試劑盒要求配試劑，混勻，靜置15min，于412nm處測各管OD值。組織勻漿中AChE活力（U·mg－1prot）＝（測定管OD值－對照管OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（1μmol·ml－1）÷蛋白含量（mg prot·ml－）。

1.2.6 尼氏染色

切片脫蠟，梯度酒精脫水后入蒸餾水。于預(yù)熱至60℃的1%甲苯胺藍30min后，以蒸餾水速洗，用95%酒精分色，鏡檢至神經(jīng)元尼氏體清晰。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 定位航行能力變化

定位航行試驗，用于檢測動物在水迷宮的學(xué)習(xí)能力［4］。經(jīng)過5d尋找隱藏平臺的定位航行訓(xùn)練，從表1可知，同模型組比較，假手術(shù)組、多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組逃避潛伏游程均縮短，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（P＜0.01）；同假手術(shù)組比較，多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組逃避潛伏游程有所延長，但無統(tǒng)計學(xué)差異；多奈哌齊組與聯(lián)合用藥組之間逃避潛伏游程無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 逃避潛伏游程變化（m）（，n＝10）

表1 逃避潛伏游程變化（m）（，n＝10）

注：同模型組比較，＊＊P＜0.01。

組 別 逃避潛伏游程變化（m）Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 均 值假手術(shù)組 17.70±6.4516.66±4.4115.95±3.4213.72±5.1211.97±3.4015.20±2.32＊＊模型組 29.68±11.8123.12±8.2417.61±7.3017.15±8.6518.49±7.6121.21±5.30多奈哌齊組 19.92±8.5517.94±6.3614.79±6.6314.62±4.212.11±3.4015.88±3.06＊＊聯(lián)合用藥組 18.22±6.3716.81±5.5714.62±3.4714.31±3.0313.59±3.5315.51±1.93＊＊

2.2 海馬系數(shù)變化

從表2可見，同模型組比較，假手術(shù)組、多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組具有統(tǒng)計學(xué)差異，其中假手術(shù)組和聯(lián)合用藥組具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異；模型組海馬系數(shù)顯著降低，多奈哌齊組、聯(lián)合用藥組海馬系數(shù)增加，提示藥物具有抗海馬萎縮的作用，其中聯(lián)合用藥效果更佳。

表2 海馬系數(shù)以及海馬組織AChE活性變化（，n＝10）

表2 海馬系數(shù)以及海馬組織AChE活性變化（，n＝10）

注：同模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 海馬系數(shù)（10－4） AChE活性（U·mg－1 prot）假手術(shù)組 7.63±1.38＊＊ 0.83±0.46＊＊模型組 5.40±0.66 3.08±1.50多奈哌齊組 7.17±1.21＊ 1.33±0.58＊聯(lián)合用藥組 7.30±2.00＊＊ 1.04±0.54＊＊

2.3 海馬組織AChE活性變化

從表2可見，同模型組比較，假手術(shù)組、多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組海馬組織AChE活性減弱，具有統(tǒng)計學(xué)差異，其中假手術(shù)組和聯(lián)合用藥組具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異；同假手術(shù)組比較，多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組海馬組織AChE活性有所增強，但無統(tǒng)計學(xué)差異；多奈哌齊組與聯(lián)合用藥組之間海馬組織AChE活性差異較小，無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 海馬CA3神經(jīng)元尼氏染色

假手術(shù)組海馬CA3區(qū)組織結(jié)構(gòu)正常，無病理變化，偶見神經(jīng)細胞損傷和尼氏體丟失。海馬錐體細胞排列整齊且緊密，胞漿染色清晰，尼氏體豐富。模型組海馬CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細胞變性壞死。海馬錐體細胞數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，排列散亂，并且胞漿內(nèi)大面積的尼氏體丟失，尼氏體呈少而小，散在分布。多奈哌齊組與聯(lián)合用藥組海馬CA3區(qū)基本病變減輕，同模型組比較，錐體細胞排列較整齊，較緊密，胞漿內(nèi)尼氏體較豐富，較清晰，見圖1。

圖1 海馬CA3神經(jīng)元尼氏染色（×400）

3 討論

近年來，Aβ學(xué)說的推出為AD模型研究提供新的思路［4］。Aβ是AD大腦中老年斑的主要成分，是AD起始和進展的關(guān)鍵因子，是AD發(fā)病機制中的一個最重要環(huán)節(jié)［5］。

Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris在1981年設(shè)計并應(yīng)用于研究大腦學(xué)習(xí)和記憶的裝置，能比較客觀的衡量動物的空間記憶，工作記憶以及空間辨別能力的改變［6］。定位航行實驗結(jié)果表明：模型組逃避潛伏游程較假手術(shù)組明顯延長，多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組明顯短于模型組，說明模型組在實驗期間學(xué)習(xí)能力有所下降，多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組學(xué)習(xí)能力明顯改善。逃避潛伏游程變化趨勢看，假手術(shù)組越來越短，符合學(xué)習(xí)越來越快特點，模型組逃避潛伏游程上下波動，多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組變化趨勢不如假手術(shù)組，但是優(yōu)于模型組，推測可能是注射Aβ1－40造成海馬損傷，導(dǎo)致學(xué)習(xí)過程不穩(wěn)定，而多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組相對于模型組有所改善。

本文結(jié)果表明，模型組海馬組織AChE活性升高，必然導(dǎo)致體內(nèi)ACh水平下降。多奈哌齊組海馬組織AChE活性有下降趨勢，說明多奈哌齊作為可逆性中樞AChE抑制劑，具有較強的AChE抑制作用。本實驗中，造模藥物Aβ1－40可使AChE活性升高，加速Ach分解，破壞膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)的信號通路，進而使膽堿能系統(tǒng)受損，導(dǎo)致認知功能障礙［7，8］。通過抑制AChE活性、增高Ach生物學(xué)作用，減輕Aβ1－40的沉積作用，加快Aβ1－40的代謝，有效阻止膽堿能神經(jīng)元的繼續(xù)丟失，緩解AD患者記憶力下降和認知功能障礙的臨床癥狀。聯(lián)合用藥組的大鼠大腦海馬組織AChE活性有明顯下降趨勢，說明除多奈哌齊發(fā)揮AChE抑制作用外，維拉帕米也可減輕Aβ1－40對AChE活性的影響。體外實驗表明Aβ可形成一種跨膜的離子通道，能有效轉(zhuǎn)運Ca2＋，維拉帕米作為鈣離子抑制劑，可能抑制Aβ所致的Ca2＋內(nèi)流，從而減輕Aβ所引起的膽堿能神經(jīng)的損害。

尼氏染色主要用于觀察海馬CA3區(qū)錐體細胞的形態(tài)特點。尼氏體是神經(jīng)細胞體內(nèi)的嗜堿性的小體或細粒，正常狀態(tài)下神經(jīng)元尼氏體都有比較固定的形態(tài)，是神經(jīng)細胞存在的重要標(biāo)志。當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時，尼氏體會減少或脫失，因而尼氏體是反映神經(jīng)元功能狀態(tài)的可靠探針［6］。本實驗采用甲苯胺藍尼氏染色法，可準(zhǔn)確地顯示尼氏體，清晰顯示神經(jīng)元及其尼氏體的形態(tài)。模型組海馬CA3區(qū)錐體細胞數(shù)量明顯減少，排列稀疏，細胞間隙明顯增大，細胞大面積丟失，殘存的細胞有大部分尼氏體變得模糊不清或消失。假手術(shù)組海馬CA3區(qū)錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體豐富，細胞無丟失且排列整齊。多奈哌齊組和聯(lián)合用藥組海馬CA3區(qū)錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體較豐富，細胞無明顯丟失，且排列較整齊。這些結(jié)果從組織學(xué)方面證實模型組具備的AD病理學(xué)特征。多奈哌齊和維拉帕米在一定程度上抑制Aβ1－40沉積，減少海馬錐體細胞丟失，細胞組織結(jié)構(gòu)正常，學(xué)習(xí)記憶功能得以較好的維持。

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