[摘要]目的：應(yīng)用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）和CM-Dil標(biāo)記技術(shù)，觀察組織工程骨在體內(nèi)形成過程中種子細(xì)胞的變化和轉(zhuǎn)歸。方法：分別用EGFP慢病毒表達(dá)和CM-Dil染料的方法標(biāo)記比格犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells， BMSCs），MTT法檢測標(biāo)記細(xì)胞的體外增殖能力。BMSCs接種珊瑚支架體外成骨誘導(dǎo)7天后，將未標(biāo)記組、EGFP組和CM-Dil組分別植入裸鼠背部皮下，空白支架作為陰性對(duì)照。術(shù)后4、8、12周取材，HE染色觀察成骨情況，EGFP組采用GFP免疫組化、CM-Dil組冰凍切片熒光顯微鏡下示蹤BMSCs在體內(nèi)的變化。結(jié)果：兩種標(biāo)記技術(shù)能高效標(biāo)記BMSCs，標(biāo)記前后細(xì)胞的體外增殖無顯著性差異（P>0.05）。細(xì)胞-支架復(fù)合物植入體內(nèi)12周后有新生骨形成，標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間延長而逐漸減少，12周后仍顯示有部分標(biāo)記細(xì)胞存活。結(jié)論：EGFP和CM-Dil可用于示蹤組織工程種子細(xì)胞，通過示蹤說明BMSCs在體內(nèi)組織工程骨成骨過程中發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞]EGFP；CM-Dil；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；示蹤；組織工程骨

[中圖分類號(hào)]Q813.1 R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）03-0406-04

The in vivo study of tissue engineered bone constructed with EGFP and CM-Dil labeled BMSCs

WU Jing-guo，XIE Fang-nan，MA Hui-yu，WANG Qian，CAO Yi-lin，XIAO Ran

(Research Center of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

Abstract: Objective To observe the effect of BMSCs in fabricating tissue engineering bone in vivo using EGFP and CM-Dil labeling technology. Methods BMSCs isolated from Beagle Dogs were labeled using EGFP and CM-Dil separately and the proliferation abilities were analyzed by MTT assay. BMSCs were seeded onto the coral scaffolds and cultured in the osteogenic medium for 7 days.Then the BMSCs/Coral constructs were implanted into the nude mices subcutaneously.The constructs were divided into three groups:Unlabeled group，EGFP group，CM-Dil group.The specimens were collected respectively at 4，8 and 12 weeks after implantation and tissue engineered bone was evaluated by HE staining.The seeded BMSCs were traced by immunohistochemistry staining of GFP in the EGFP group and directly observed in the frozen section under the fluorescence microscope in the CM-Dil. Results BMSCs were labeled efficiently by both GFP and CM-Dil labeling technology and there was no statistical significance in BMSCs proliferation after labeling (P>0.05).The histological observation of three groups showed that there were engineered bone formed around the pores of the scaffolds after 12 weeks implantation. The labeled BMSCs were decreased gradually and could be detected up to 12 weeks in vivo. Conclusion EGFP and CM-Dil can be used to label and trace the seeded BMSCs in tissue engineered bone formation in vivo.

Key words: EGFP; CM-Dil; BMSCs; lable; tissue engineering bone

BMSCs是一類存在于骨髓中除造血干細(xì)胞以外的成體干細(xì)胞，其自我更新能力及多向分化潛能已被廣泛認(rèn)識(shí)，是組織工程研究領(lǐng)域種子細(xì)胞的理想來源[1-3]。在骨組織工程研究中，BMSCs復(fù)合生物材料植入體內(nèi)不但能夠生成新生的骨質(zhì)，而且還可能具有分泌細(xì)胞因子、趨化機(jī)體自身細(xì)胞、促進(jìn)局部微血管化等功能[4-5]，要深入研究BMSCs在組織工程骨形成過程中的作用，需要應(yīng)用有效而不影響其功能的標(biāo)記方法。

本實(shí)驗(yàn)分別用EGFP和CM-Dil標(biāo)記的BMSCs復(fù)合珊瑚支架植入裸鼠體內(nèi)，示蹤BMSCs的存活情況，以及細(xì)胞標(biāo)記后復(fù)合物的成骨能力。進(jìn)一步明確BMSCs在裸鼠體內(nèi)的異位成骨作用，并為組織工程種子細(xì)胞提供簡便直觀的標(biāo)記方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：比格犬，雄性，12月齡，體重13kg，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供；裸鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器：Ficoll分離液（GE，瑞士）；DMEM、Hank's液、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、雙抗（GIBCO，美國）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、維生素C、茜素紅、油紅O、MTT（Sigma，美國）；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）；EGFP病毒提取液（本實(shí)驗(yàn)室王黔老師提供）；CM-Dil（Molecular Probes，美國）；堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成，南京），Ⅱ型膠原、GFP免疫組織化學(xué)一抗和二抗（中杉金橋，北京）；多聚甲醛、戊二醛（益利精細(xì)化學(xué)品，北京）；Quanta 200 環(huán)境掃描電子顯微鏡（FEI，捷克）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

1.3.1 BMSCs的分離培養(yǎng)：比格犬以0.12ml/kg的劑量肌注氯胺酮/速眠新（兩者2:1混合）麻醉，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，用骨穿針于髂后上嵴穿入骨髓腔，然后用含有1ml肝素（50U/ml）的20ml的注射器負(fù)壓抽取骨髓液4ml，加入4ml Hank's液混勻，小心加入含有4ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的15ml離心管中，2 000r/min離心20min，吸取中間白色云霧狀的有核細(xì)胞層，DMEM洗滌2次，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液按1.0×106/ml的密度接種直徑為10cm的培養(yǎng)皿，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48h后換液，清除未貼壁的細(xì)胞，7天后細(xì)胞克隆達(dá)80%融合，胰酶消化，按5.0×104/ml的密度傳代。選取第二代細(xì)胞備用。

1.3.2 三系誘導(dǎo)分化及鑒定：①成骨誘導(dǎo)：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10-8 M地塞米松、0.01 M β-磷酸甘油鈉、0.05g/L維生素C、10%胎牛血清、1 雙抗）培養(yǎng)BMSCs 21天，4%多聚甲醛固定，堿性磷酸酶染色試劑盒染色；體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇固定1h，2%茜素紅染色；4% 多聚甲醛固定，加入抗骨橋蛋白一抗和二抗，免疫熒光檢測；②成軟骨誘導(dǎo)：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10ng/ml TGF-β1、40ng/ 地塞米松、50ng/ml維生素C、10%胎牛血清、1% 雙抗）誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍(lán)、番紅O染色；4%多聚甲醛固定，加入抗Ⅱ型膠原一抗和二抗，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測；③成脂誘導(dǎo)：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0.5mM IBMX、10-5 M胰島素、0.2mM吲哚美辛、10-6 M地塞米松、10%胎牛血清、1%雙抗）誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，4%多聚甲醛固定，60%異丙醇處理，油紅O染色。

1.4 EGFP和CM-Dil標(biāo)記BMSCs

1.4.1 EGFP標(biāo)記BMSCs：成骨誘導(dǎo)后的BMSCs傳至P2代，達(dá)到80% 細(xì)胞融合后去除原成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入無胎牛血清的DMEM 5 ml，然后在其中加入制備好的病毒液600μl，并加入Lipofectamine 2000以增強(qiáng)感染效率。24h后，棄掉含病毒的培養(yǎng)基，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測細(xì)胞的增增殖能力。

1.4.2 CM-Dil標(biāo)記BMSCs：收集P2代BMSCs制成密度為1.0×107/ ml細(xì)胞懸液（PBS懸?。?ml細(xì)胞懸液中加入40μl CM-Dil（1g/L），此時(shí)CM-Dil的終濃度為40μM。細(xì)胞懸液置于37℃，3min，然后冰浴15min，洗滌后按5.0×104/ml的密度接種到培養(yǎng)皿中。24h后，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記后的細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力。

1.5 BMSCs接種珊瑚支架植入裸鼠體內(nèi)及檢測

1.5.1 珊瑚支架制備：選取西沙群島產(chǎn)致密橙黃濱珊瑚，加工成體積為5mm×5mm×1mm大小。用5%次氯酸鈉溶液浸泡2周，3天換液一次，然后用三蒸水沖洗，煮沸10min×3次，超聲清洗（5次，每次10min）后80℃烘干24h，高溫高壓滅菌后備用。

1.5.2 接種細(xì)胞：分別收集EGFP和CM-Dil標(biāo)記后的BMSCs，以2.0×107/ml的密度接種珊瑚支架，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)3h、3天、7天，2.5% 戊二醛固定，酒精脫水干燥，掃描電鏡觀察材料的孔隙率和接種后細(xì)胞-材料的粘附情況。

1.5.3 細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠背部皮下：裸鼠12只，分3組。各組裸鼠右側(cè)背部皮下均植入空白珊瑚支架（每只3塊），左側(cè)分別植入體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的未標(biāo)記、EGFP標(biāo)記、CM-Dil標(biāo)記的細(xì)胞-支架復(fù)合物。

1.5.4 取材：三組分別于術(shù)后4周、8周、12周取材，30% 甲酸脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色，觀察其成骨情況；EGFP標(biāo)記組通過GFP免疫組織化學(xué)示蹤植入BMSCs；CM-Dil標(biāo)記組冰凍切片DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察植入BMSCs的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。MTT法各檢測時(shí)間點(diǎn)每組讀取4孔OD值，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs多向分化鑒定及EGFP、CM-Dil標(biāo)記

2.1.1 分化鑒定：BMSCs原代培養(yǎng)7天，貼壁細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，增殖迅速并生成大量克隆。成骨誘導(dǎo)21天后，堿性磷酸酶染色陽性（圖1A），茜素紅染色可見成骨分化后鈣質(zhì)沉積（圖1B）；成軟骨誘導(dǎo)14天后，番紅O染色陽性（圖1C），Ⅱ 型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)可見細(xì)胞分泌??型膠原（圖1D）；成脂誘導(dǎo)14天后，鏡下可見細(xì)胞質(zhì)中大量脂滴出現(xiàn)（圖1E），油紅O染色陽性（圖1F）。

2.1.2 標(biāo)記：EGFP、CM-Dil標(biāo)記BMSCs 24h后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)80% 以上的細(xì)胞激發(fā)出綠色熒光、紅色熒光（圖2）。MTT法檢測結(jié)果顯示7天細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期，EGFP組、CM-Dil組與未標(biāo)記組的生長曲線基本一致，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），表明標(biāo)記對(duì)細(xì)胞增殖活性無明顯影響。

2.2 體外培養(yǎng)BMSCs-支架復(fù)合物：電鏡掃描細(xì)胞-支架復(fù)合物發(fā)現(xiàn)，接種3天后細(xì)胞已分泌大量基質(zhì)，逐漸充滿整個(gè)孔隙。復(fù)合物體外培養(yǎng)7天置于熒光倒置顯微鏡下直接觀察，也看到激發(fā)出熒光的細(xì)胞在支架上黏附生長（圖3）。

2.3 體內(nèi)植入復(fù)合物的組織學(xué)觀察：各組復(fù)合物植入體內(nèi)4周，材料邊緣（珊瑚支架脫鈣處理）均出現(xiàn)少量新生骨基質(zhì)（紅染區(qū)域），骨基質(zhì)包圍大量新生的類骨質(zhì)，形態(tài)似纖維組織，而空白材料植入后發(fā)現(xiàn)纖維組織長入，無骨基質(zhì)形成；植入8周，隨著類骨質(zhì)的成熟，骨基質(zhì)的范圍逐漸擴(kuò)大；植入12周，大部分區(qū)域成熟骨質(zhì)已經(jīng)形成，骨陷窩及其中的骨細(xì)胞清晰可見（圖4），而空白材料珊瑚支架在體內(nèi)逐漸降解，被大量纖維組織替代。

2.4 EGFP、CM-Dil標(biāo)記BMSCs體內(nèi)示蹤觀察：EGFP免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)，4周大量表達(dá)GFP的細(xì)胞存在于植入的細(xì)胞-支架復(fù)合物中，8周逐漸減少，到12周僅能在組織邊緣看到少量GFP陽性細(xì)胞（圖5A）。CM-Dil標(biāo)記組冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察顯示植入4周，標(biāo)記后的BMSCs發(fā)出紅色熒光，熒光出現(xiàn)在材料邊緣區(qū)域，植入8周，紅色熒光仍然存在，熒光范圍比4周明顯減少，植入12周，紅色熒光進(jìn)一步減少，只存在于少量細(xì)胞集落的邊緣區(qū)域（圖5B）。

3 討論

BMSCs來源廣泛，取材方便，具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱、韌帶、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨髓基質(zhì)等組織細(xì)胞分化的潛能，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和組織工程、干細(xì)胞治療等領(lǐng)域[6-7]。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記示蹤是相關(guān)研究中必不可少的環(huán)節(jié)，在骨組織工程研究中，由于骨組織鈣鹽沉積的特點(diǎn)，給種子細(xì)胞的標(biāo)記示蹤檢測帶來了困難，難以進(jìn)行長期示蹤，從而需要探索有效的骨組織工程種子細(xì)胞的標(biāo)記方法。

本實(shí)驗(yàn)在裸鼠體內(nèi)成功建立了異位成骨動(dòng)物模型。支架材料應(yīng)用天然濱珊瑚，孔隙率60% 左右，孔徑140～260μm，符合骨組織工程生物材料的要求[8-10]。分離培養(yǎng)比格犬BMSCs，復(fù)合支架體外成骨誘導(dǎo)，電鏡掃描顯示BMSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)充滿材料孔隙，說明細(xì)胞-材料相容性良好。空白珊瑚支架植入裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)3個(gè)月完全降解，和文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11]，而細(xì)胞-支架復(fù)合物由于細(xì)胞分泌大量基質(zhì)，延緩了材料降解速率，從而有利于BMSCs以材料的三維結(jié)構(gòu)為支撐形成組織工程骨，12周組織學(xué)發(fā)現(xiàn)形成了大量成熟骨基質(zhì)。

GFP已廣泛用于蛋白質(zhì)、細(xì)胞器的標(biāo)記及基因表達(dá)的研究[12-14]，其突變體EGFP的熒光強(qiáng)度是野生型的35倍。CM-Dil是親脂性熒光染料，嵌入細(xì)胞膜從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞[15]，近年來逐漸用于細(xì)胞移植的示蹤研究，具有使用簡便、染色快速、熒光衰減慢、標(biāo)記效率高等優(yōu)點(diǎn)[16-19]。本實(shí)驗(yàn)中EGFP、CM-Dil標(biāo)記BMSCs的效率在80% 以上，而且細(xì)胞標(biāo)記后增殖能力未受明顯影響，植入體內(nèi)仍具有成骨活性。通過免疫組化和熒光觀察示蹤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，植入4周后標(biāo)記效果仍顯著，隨著時(shí)間延長，被標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，到12周少量BMSCs存活，大部分已被機(jī)體自身細(xì)胞取代，說明植入的BMSCs進(jìn)行著和機(jī)體自身細(xì)胞相同的生命活動(dòng)，從增殖分化為終末細(xì)胞發(fā)揮生理功能，到最終走向死亡，在這一過程中BMSCs不僅能分化為成骨細(xì)胞，而且可能通過旁分泌、自分泌等作用，分泌SDF-1、VEGF等細(xì)胞因子，發(fā)揮趨化、誘導(dǎo)分化機(jī)體自身細(xì)胞等功能，最終機(jī)體自身細(xì)胞取代BMSCs，形成新生骨組織。

本實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用EGFP和CM-Dil標(biāo)記示蹤BMSCs，為探討種子細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸尋找有效的標(biāo)記方法。結(jié)合兩種標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)部分BMSCs至少能存活12周以上，也證實(shí)了早期骨生成過程中種子細(xì)胞起到重要作用。比較兩種標(biāo)記方法，EGFP需經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建、病毒轉(zhuǎn)染、病毒液提取和滴度測定等步驟，且標(biāo)本要用免疫組織化學(xué)方法檢測，操作復(fù)雜；而CM-Dil標(biāo)記操作和檢測雖然相對(duì)簡單，但CM-Dil會(huì)隨著細(xì)胞分裂導(dǎo)致細(xì)胞膜染料減少、熒光衰減[20]，此外骨組織鈣鹽沉積也給熒光檢測帶來了不便。因此，為探討種子細(xì)胞在組織工程骨形成中的作用及轉(zhuǎn)歸，需進(jìn)一步尋找和優(yōu)化標(biāo)記方法。

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[收稿日期]2011-09-20 [修回日期]2011-11-28

編輯/張惠娟