[摘要]目的：探討在共培養(yǎng)系統(tǒng)下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為唾液腺腺泡樣細胞的實驗。方法：以純化1代SD大鼠頜下腺腺泡細胞和3代骨髓間充質(zhì)干細胞作為共培養(yǎng)實驗對象。實驗分組：含唾液腺培養(yǎng)液的共培養(yǎng)組；含10%FBS、 DMEM/F12的共培養(yǎng)組；含唾液腺培養(yǎng)液的非共培養(yǎng)組；含10%FBS、DMEM/F12的非共培養(yǎng)組。培養(yǎng)1個月經(jīng)α-淀粉酶（α-amylase）免疫組化染色各組的MSCs，計算陽性細胞數(shù)得出MSCs的轉(zhuǎn)化率，并且通過光鏡和電鏡鑒定細胞形態(tài)變化。結(jié)果：各組誘導(dǎo)的MSCs經(jīng)α-amylase染色，共培養(yǎng)組陽性細胞數(shù)較非共培養(yǎng)組多(P＜0.05），且誘導(dǎo)成功的細胞在鏡下形態(tài)類似于唾液腺腺泡細胞。結(jié)論：在共培養(yǎng)條件下成功實現(xiàn)了MSCs向 SGCs的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)化，唾液腺專用培養(yǎng)液能夠提高SGCs的誘導(dǎo)效率。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞；唾液腺腺泡細胞；共培養(yǎng)；誘導(dǎo)

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）03-0419-03

The research of rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into salivary gland acinar-like cells

LIANG Liang，SUN Mo-yi，LI Jian-hu，YANG Yong-qin，SHEN Zhi-yuan，SU Zhong-ping

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，The Fourth Militiary Medical University，Xi＇an 710032，Shaanxi，China)

Abstact: Objective To explore the possibility of rat bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs） differentiation into salivary gland acinar-like cells induced by co-culture with salivary gland acinar cells(SGCS) in vitro. Methods SGCs of passage 1 and MSCs of passage 3 were taken as subject investigated.Following groups were allocated：co-culture with salivary gland medium group；co-culture with 10％ FBS DMEM/F12 group；salivary gland medium group;group with 10% FBS DMEM/F12.MSCs of every group were identified by immunohistochemiscal analysis withα-amylase After a month cultivation.MSCs conversion rate is attained by calculation of the number of positive cells.By the optical microscope and scanning electron microscope observes the morphological changes of cells. Results Compared with none-co-cultured groups，Most cells in co-culture groups were stained by α-amylase（P＜0.05). Conclusions The cells of success induction morphology which similar to salivary gland acinar cells at the optical microscope and scanning electron microscope display.MSCs could differentiate into SGs at phenotype and molecule level by co-culture of SGs in vitro.Changing the experimental conditions and can improve induction efficiency.

Key words：bone marrow mesenchymal stem cell；salivary gland acinar cell；co-culture；induction

唾液腺先天缺失、唾液腺手術(shù)、頭頸部惡性腫瘤術(shù)后放療等都會造成唾液腺分泌功能障礙，導(dǎo)致口干、吞咽困難、齲病的發(fā)生等等。唾液腺出現(xiàn)功能障礙多是由于細胞受損或不足引起的，所以修復(fù)細胞缺損是有效的治療方法。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞越來越多的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-2]。本實驗通過共培養(yǎng)系統(tǒng)將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為唾液腺腺泡樣細胞，并對其進行鑒定，為臨床唾液腺腺泡細胞損傷修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料：10～14天的SD大鼠（購買于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心）。輕化可的松、表皮生長因子(EGF)、肝生長因子（HGF）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、L-谷氨酰胺、Ⅱ型膠原酶均購自于美國 Sigma公司，青鏈霉素、胰島素、HBSS、DMEM／F12培養(yǎng)基均購自于美國Thermo公司，兔抗鼠α-Amylase抗體（武漢博士德）、兔抗鼠CK-8抗體（武漢博士德）、胎牛血清（FBS）（杭州四季青）、羊抗兔二抗試劑盒（北京康為）、異丙腎上腺素（上海禾豐）、Transwell小室（美國corning公司）。

1.2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)：用頸椎脫臼法處死SD大鼠，75%酒精浸泡5min。解剖分離股骨及脛骨，剪斷骨兩端顯露骨髓。吸取4ml培養(yǎng)基（DMEM/F12，含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）到注射器，沖洗骨髓腔內(nèi)的細胞。將帶有骨髓細胞的培養(yǎng)液吸入到離心管中，1000r/min離心6min，去上清，加培養(yǎng)液，吹打均勻后分裝到35mm培養(yǎng)皿，放入37℃、5%CO2孵育，隔日后換液。一周傳代以1:3接種到培養(yǎng)皿中。

1.2.2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞和鑒定：選取生長良好的3代MSCs在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)：細胞生長良好，形態(tài)均一，為長梭形，排列整齊，成旋渦狀(圖1)。成骨誘導(dǎo)：消化3代細胞以1×105濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長融合到75%時添加誘導(dǎo)液（DMEM/F12，含10%FBS、1mmol/L地塞米松、1mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50mmol/L 維生素C），每三天換一次液，2周時茜素紅染色見大量紅色結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)：同樣取3代細胞以1×105濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，添加誘導(dǎo)液（DMEM/F12，含10%FBS、1mmol/L地塞米松、0.2mmol/L吲哚美辛、50mmol/L IBMX），2周后油紅O染色見細胞體積變大，胞漿內(nèi)可見紅色脂滴。

1.3 唾液腺腺泡細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

1.3.1 唾液腺腺泡細胞的分離、培養(yǎng)：頸椎脫臼法處死SD鼠，無菌操作下摘取雙側(cè)頜下腺，顯微鏡下去除腺體周圍的被膜，脂肪組織，用D-Hanks（HBSS）液反復(fù)漂洗標(biāo)本，剪成1mm3大小的組織塊。置于37℃恒溫?fù)u床用0.125%Ⅱ型膠原酶消化40min，取上清液通過100目篩網(wǎng)過濾，濾液移入離心管，離心1000r/min，6min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液（DMEM/F12培養(yǎng)液、10%FBS、5mg/L氫化可的松、100 U/ml青霉素、0.1μg/ml鏈霉素、2mg/L異丙腎上腺素、5g/L胰島素、2mmol/L的L-谷氨酰胺、5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、10μg/L的EGF、10μg/L的HGF），細胞計數(shù)后以1×105/ml的細胞濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中。純化唾液腺腺泡細胞，9天后傳代。

1.3.2 唾液腺腺泡細胞的鑒定：取1代純化的SD大鼠頜下腺腺泡細胞于倒置相差顯微鏡下可見細胞生長良好，形態(tài)均勻，為鋪路石狀。掃面電鏡：一代的細胞爬片后經(jīng)4％多聚甲醛溶液4℃固定過夜，乙醇梯度脫水，干燥鍍膜，鏡下可見：細胞表面不平，突起多且長短不一，有些細胞表面可見分泌顆粒。α-淀粉酶染色陽性。

1.4 取第3代的MSCs與1代的SGCs作為實驗對象，進行實驗分組：A組:含唾液腺培養(yǎng)液的共培養(yǎng)組；B組：含10%FBS、 DMEM/F12共培養(yǎng)組；C組：含唾液腺培養(yǎng)液非共的培養(yǎng)組；D組：含10%FBS、 DMEM/F12非共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)裝置是帶有transwell小室的24孔板。0.4μm的transwell透明聚碳酸酯膜有效的阻止了兩種細胞的通過，而培養(yǎng)液、細胞的代謝物以及各種生長因子能夠相互通透。共培養(yǎng)組：將SGCs以2×104接種到24孔板transwell膜上，MSCs以1×104接種到帶有下層。非共培養(yǎng)組：只接種1×104的MSCs到24孔板底部。各培養(yǎng)一個月后通過電鏡觀察誘導(dǎo)細胞的形態(tài)，經(jīng)ck-8染色，α-Amylase染色。

1.5 采用χ2檢驗分析四個實驗組誘導(dǎo)的MSCs經(jīng)α-amylase染色后的陽性細胞數(shù)。應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計軟件對免疫組化染色結(jié)果進行分析。采用總體方差分析法，P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各實驗組培養(yǎng)1個月后，掃描電鏡顯示：共培養(yǎng)組誘導(dǎo)的細胞呈現(xiàn)唾液腺腺泡樣細胞的形態(tài)，非共培養(yǎng)組未見。共培養(yǎng)組誘導(dǎo)的細胞經(jīng)α-amylase染色呈現(xiàn)陽性，細胞胞漿深著色，而非共培養(yǎng)組基本未見陽性細胞，從柱狀圖可明顯看出各組MSCs培養(yǎng)1個月通過α-amylase染色細胞計數(shù)情況(圖9)。對其分析，每組取四個鏡下視野的平均值，并記錄（表1）。

3 討論

3.1 頭頸部癌癥患者放療后常造成唾液腺上皮細胞的損傷甚至萎縮，雖然在放療時采取了一定保護措施，卻仍然不能完全防止這種副作用的發(fā)生。研究證實，干細胞療法是解決唾液腺上皮細胞的損傷或萎縮的一種可行性治療手段。骨髓間充質(zhì)干細胞具有很高的可塑性，一定條件下能分化為脂肪細胞、成骨細胞、肝細胞[3-4]等細胞，在各個系統(tǒng)疾病的治療中擁有巨大的潛力。近年來，同源性骨髓間充質(zhì)干細胞的移植逐漸成為受損器官或組織修復(fù)的重要治療手段之一，其方法是：體外提取培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，然后在移植到患者體內(nèi)以修復(fù)受損的組織或器官[5-6]。

3.2 異體細胞的移植，會出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，而自體細胞移植就能減少或避免這種情況的發(fā)生。但是，唾液腺腺泡細胞是一種終末分化的細胞，體外增殖能力差，一般培養(yǎng)到第五代就很難再傳代[7]，單純靠體外擴增自身剩余的唾液腺腺泡細胞很難。近年研究認(rèn)為，自身來源的骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成為唾液腺腺泡細胞后就能夠解決這個難題。

3.3 蔣澤生等[8]通過共培養(yǎng)將人骨髓多能成體祖細胞誘導(dǎo)分化為肝細胞樣細胞。Sumita Y等[9]將骨髓間充質(zhì)干細胞注射到鼠尾靜脈，在體內(nèi)獲得了唾液腺損傷修復(fù)所需的種子細胞。結(jié)合以上結(jié)論，本實驗通過體外培養(yǎng)，利用差速貼壁和差速消化法[10]提純SD大鼠頜下腺腺泡細胞（SGCs）和骨髓間充質(zhì)干細胞，共培養(yǎng)誘導(dǎo)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為唾液腺腺泡樣細胞，進而獲得唾液腺損傷所需要的種子細胞，為唾液腺組織缺損修復(fù)提供了一個可靠的組織學(xué)依據(jù)。

3.4 在唾液腺培養(yǎng)液中添加多種生長因子，可以刺激唾液腺腺泡細胞體外分泌[11]。本實驗設(shè)置含生長因子和未含生長因子的共培養(yǎng)組，之后進行α-amylase染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)條件下，添加生長因子的共培養(yǎng)組與未添加組相比，陽性細胞數(shù)增多，誘導(dǎo)效率提高。由此推斷，唾液腺腺泡細胞產(chǎn)生的分泌物增加，而這些分泌物中又可能含有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，同時提高了誘導(dǎo)的效率。

3.5 由于機體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，本實驗誘導(dǎo)的唾液腺腺泡樣細胞與體內(nèi)的唾液腺腺泡細胞存在一定的差異，但為唾液腺腺泡細胞的損傷修復(fù)體外基礎(chǔ)研究提供了一個較為可靠的細胞理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1]莊淑波，劉毅.骨髓間充質(zhì)干細胞在整形外科的應(yīng)用前景[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2006，15(3): 347-349.

[2]金麗娟，張誠.骨髓間充質(zhì)干細胞在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2006，15(5）：603-605.

[3]Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science，1999，284(5411):143-147.

[4]Hennrick KT，Keeton AG，Nanua S，et al.Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype[J]. AJRCCM，2007，175(11):1158-1164.

[5]Gerburg K，F(xiàn)elix S，Alexander，G，et al. Transdifferentiated mesenchymal stem cells as alternative therapy in supporting nerve regeneration and myelination[J]. Cell Mol Neurobiol，2006，26(7/8):1235-1252.

[6]McFarlinK， Gao X，Liu YB，et al. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells accelerate wound healing in the rat[J].Wound Repair Regen，2006，14(4):471-478.

[7]王靜，吳軍正，郭富平，等.人涎腺上皮細胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的初步研究[J].實用口腔醫(yī)學(xué)，2005，21(5)：587-591.

[8]蔣澤生，高毅，慕寧.共培養(yǎng)誘導(dǎo)人骨髓多能成體祖細胞分化為肝細胞樣細胞[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87(6):414-418.

[9]Sumita Y，Liu Y，Khalili S，et al. Bone marrow-derived cells rescue salivary gland function in mice with head and neck irradiation[J].Int J Biochem Cell Biol，2010，43(1):80-88.

[10]黃巍巍，譚學(xué)新，李波，等. 組織塊法培養(yǎng)大鼠頜下腺細胞的實驗研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，39（3）:194-196.

[11]周青，王玉新，王緒凱，等. 肝細胞生長因子對大鼠頜下腺細胞增殖的影響[J].中華實驗外科雜志，2002，19(6):538-539.

[收稿日期]2011-10-13 [修回日期]2011-12-28

編輯/張惠娟