[摘要]目的：探討 PGP9.5和CyclinD1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)、Bowen病中的表達(dá)及臨床意義。方法：用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)22例CSCC，31例Bowen病及10例正常皮膚組織中PGP9.5和CyclinD1的表達(dá)情況。結(jié)果：PGP9.5與CyclinD1在CSCC的表達(dá)明顯高于正常皮膚組（P=0.006，P=0.00057，<0.05）和Bowen病組（P<0.05），PGP9.5與CyclinD1在低分化鱗癌的表達(dá)明顯強(qiáng)于高分化鱗癌的表達(dá)（P<0.05）。在CSCC、Bowen病中，PGP9.5與CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)存在相關(guān)性。結(jié)論：PGP9.5、CyclinD1的高表達(dá)和鱗癌細(xì)胞分化程度有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]皮膚鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)；Bowen??；PGP9.5；CyclinD1；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）03-0424-03

Expression and Significance of PGP9.5 and CyclinD1 in Human Skin Squamous Cell Carcinoma and Bowen's Disease

NIE Jian-jun1，2，ZENG wei-hui1，GENG song-mei1，XU-lei2

(1.Department of Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004，Shaanxi，China; 2.Department of Dermatology of The Second Hospital of Chengdu )

Abstract: Objective To study the expression of PGP9.5and CyclinD1 in Cutaneous squamous cell carcinoma and Bowen's disease and exploring the relationship between them and to confirm their role in development of the tumor. Methods Immunohistochemical S-P method was used to examine the expressions of PGP9.5 and CyclinD1 in 22 cases of CSCC， 31cases of Bowen's disease， and 10 cases of normal skin. Results The expression of PGP9.5 and CyclinD1 was significantly higher in CSCC than in normal tissue and Bowen's disease （P=0.006，P=0.00057<0.05）. The expression of PGP9.5 and CyclinD1 was significantly stronger in poorly differentiated CSCC than in well differentiated CSCC（P<0.05）. The positive expression of PGP9.5 and CyclinD1 are positive correlations in CSCC and Bowen's disease. Conclusion The co-expression of PGP9.5 and CyclinD1 is related with carcinogenesis and m alignant progression of CSCC and Bowen's disease.

Key words:Cutaneous Squamous cell carcinoma(CSCC); Bowen's disease;PGP9.5;CyclinD1; immunohistochemistry

蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product，PGP9.5)屬于泛素水解酶家族，廣泛分布于神經(jīng)元分化的各個(gè)階段，為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的標(biāo)志物[1-2]。近年發(fā)現(xiàn)PGP9.5在肺、食管及間充質(zhì)等的腫瘤有高表達(dá)[3-6]。PGP9.5通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解細(xì)胞核內(nèi)蛋白及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）屬于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的發(fā)生中起很重要的作用。有關(guān)PGP9.5介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑在CyclinD1參與的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的機(jī)制中發(fā)揮的作用，及PGP9.5和CyclinD1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展所扮演的角色受到了學(xué)者們的關(guān)注。筆者應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)皮膚鱗狀細(xì)胞癌、Bowen病及正常皮膚組織中PGP9.5及CyclinD1的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料收集：2006年1月至2010年3月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科皮膚鱗狀細(xì)胞癌蠟塊22例，其中男10例，女12例，年齡56～83歲Bowen病31例，男14例，女17例，年齡58～82歲。另選用美容手術(shù)切除的正常皮膚組織10例做對(duì)照，其中男4例，女6例，年齡20～65歲。

試劑：①兔抗人PGP9.5多克隆抗體 編號(hào)：（ZA-0263）；②兔抗人CyclinD1單克隆抗體編號(hào)：（ZA-0101）；③SP通用試劑盒9000，均購(gòu)自北京中杉生物科技有限公司。

1.2 方法：10%福爾馬林緩沖液浸泡24h后石蠟包埋。4μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色5張，采用SP法免疫組化染色， 按說(shuō)明書操作。每批染色用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每例取一張切片按常規(guī)行HE染色，光鏡下進(jìn)行病理分級(jí)，并與免疫組化結(jié)果對(duì)照觀察。

1.3 結(jié)果判斷：PGP9.5陽(yáng)性染色主要表達(dá)細(xì)胞胞漿的棕黃色或褐色顆粒，CyclinD1以細(xì)胞核染色為棕黃色顆粒為陽(yáng)性。同一標(biāo)本高倍鏡下（10×40）隨機(jī)各取5個(gè)視野鱗癌組織計(jì)數(shù)其細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分：取5個(gè)高倍鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞的平均值。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)弱等級(jí)按PGP 9.5 / CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)占腫瘤細(xì)胞百分比表示0級(jí)（<0.5%），+（1%～10%），++（10%～20%），+++（>20%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)采用半定量等級(jí)資料，觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出表達(dá)陽(yáng)性級(jí)別，然后進(jìn)行等級(jí)資料統(tǒng)計(jì)，采用非參數(shù)等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，并計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)判定關(guān)聯(lián)程度。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGP9.5 和CyclinD1在正常皮膚、Bowen病和CSCC中的表達(dá)（表1）：PGP9.5在正常皮膚上皮細(xì)胞表達(dá)基本呈陰性，黑色素細(xì)胞陽(yáng)性。汗腺、毛囊旁神經(jīng)纖維組織黃褐色染色。在10例正常組織標(biāo)本中有1例上皮細(xì)胞染色弱陽(yáng)性（陽(yáng)性率10%）。在31例Bowen病例標(biāo)本中，異型的角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，呈黃褐色（圖1），有11例染色陽(yáng)性（陽(yáng)性率35.5%）。在22例CSCC標(biāo)本中，有14例呈陽(yáng)性染色，腫瘤細(xì)胞胞漿染色黃褐色、棕褐色（圖2、3）（陽(yáng)性率63.6%）。正常皮膚與Bowen病的表達(dá)差異比較，χ2=2.37，P>0.05。PGP9.5在二者之間表達(dá)無(wú)顯著差異。PGP9.5在正常皮膚、CSCC的陽(yáng)性表達(dá)差異比較P=0.006<0.05，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bowen病與CSCC的PGP9.5表達(dá)差異比較，χ2=4.09，P<0.05，二者表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PGP9.5在CSCC的表達(dá)明顯高于Bowen病組織。

CyclinD1在正常皮膚組織的細(xì)胞核表達(dá)呈陰性，在10例正常皮膚標(biāo)本中，有1例弱陽(yáng)性（陽(yáng)性率10%）。在Bowen病中，CyclinD1在異型的角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞核染色陽(yáng)性，呈黃褐色（圖4）。在31例Bowen病例標(biāo)本中，有15例染色陽(yáng)性，（陽(yáng)性率48.4%）。在CSCC中，CyclinD1在鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)呈棕褐色（圖5、6）。在22例CSCC例標(biāo)本中，有17例呈陽(yáng)性染色（陽(yáng)性率77.3%）。CyclinD1在正常皮膚與Bowen病陽(yáng)性表達(dá)比較χ2=4.82，P<0.05。CyclinD1在正常皮膚、CSCC的陽(yáng)性表達(dá)比較P=0.00057<0.01.差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CyclinD1在CSCC的表達(dá)明顯高于正常組織。Bowen病與CSCC的表達(dá)比較，χ2=4.48，P<0.05，二者表達(dá)有顯著差異。CyclinD1在CSCC的表達(dá)明顯高于Bowen病。

2.2 PGP9.5和CyclinD1在CSCC不同病理分級(jí)中的表達(dá)（表2）：PGP9.5在CSCC不同病理分級(jí)中的鱗癌細(xì)胞染色的比率及染色強(qiáng)度不同，在12例高分化鱗癌（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）中，有6例表達(dá)陰性，強(qiáng)陽(yáng)性（++、+++）3例，低分化鱗癌（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中有2例表達(dá)陰性，強(qiáng)陽(yáng)性7例，根據(jù)兩組等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)P<0.05。PGP9.5在CSCC不同分級(jí)的表達(dá)有顯著差別。低分化鱗癌PGP9.5的表達(dá)比高分化鱗癌的表達(dá)強(qiáng)。

CyclinD1在CSCC不同病理分級(jí)中的鱗癌細(xì)胞染色的比率及染色強(qiáng)度不同，在12例高分化鱗癌中，有4例表達(dá)陰性，強(qiáng)陽(yáng)性4例，低分化鱗癌中有1例表達(dá)陰性，強(qiáng)陽(yáng)性7例，根據(jù)兩組等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)P<0.05。CyclinD1在CSCC不同病理分級(jí)中陽(yáng)性表達(dá)有顯著差別。低分化鱗癌CyclinD1的表達(dá)比高分化鱗癌的表達(dá)強(qiáng)。

2.3 PGP9.5和CyclinD1分別在Bowen病組織和CSCC組織陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析顯示：Bowen病組（P<0.05，r=0.53）。CSCC組（P<0.05，r=0.44）表明PGP9.5和CyclinD1在Bowen病組織和CSCC組織陽(yáng)性表達(dá)均有相關(guān)性。

3 討論

3.1 PGP9.5又名泛素羧基末端水解酶1(ubiquitin-C- terminal hydrolase L1，UCHL-1)是神經(jīng)元特異性羧基末端水解酶，PGP9.5是蛋白降解途徑中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞水解途徑中調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂周期和死亡。研究發(fā)現(xiàn)PGP9.5存在于多種腫瘤組織中，其過(guò)度表達(dá)和腫瘤的發(fā)展有正相關(guān)關(guān)系。但其在皮膚腫瘤中的研究尚未見報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PGP9.5在CSCC的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織和Bowen病組織（P<0.05），提示PGP9.5在CSCC的發(fā)生及由Bowen病向CSCC發(fā)展過(guò)程中可能起著一定的作用。而PGP9.5在低分化鱗癌的表達(dá)強(qiáng)度比高分化鱗癌明顯增加（P<0.05），即在惡性程度較高的CSCC中，PGP9.5的表達(dá)較高，提示PGP9.5在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的致瘤性轉(zhuǎn)化中也可能起一定的作用。在對(duì)食管鱗癌的研究[2]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PGP9.5的鱗癌細(xì)胞對(duì)紫外線的敏感性增加，推測(cè)高表達(dá)的PGP9.5和紫外線的長(zhǎng)期照射可能在CSCC的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起協(xié)同作用。至于高表達(dá)PGP9.5的Bowen病是否更易發(fā)展為CSCC，需進(jìn)一步研究。Bheda等[7]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PGP9.5與β-Catenin/TCF信號(hào)之間有正相關(guān)調(diào)節(jié)作用。因此PGP9.5也可能通過(guò)該信號(hào)依賴的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)c-myc，cyclin D，c-jun，survivin等原癌基因蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致CSCC的發(fā)生。

3.2 CyclinD1作為細(xì)胞周期中重要的調(diào)控因子，其基因多態(tài)性的不同對(duì)腫瘤的形成有不同的影響[8-9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Bowen病、CSCC中CyclinD1的研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在CSCC、Bowen病和正常皮膚之間的表達(dá)有顯著差異（P<0.05）。低分化CSCC的表達(dá)比高分化CSCC強(qiáng)，提示CyclinD1與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及惡性程度有關(guān)。這與其他腫瘤的研究結(jié)果一致[10-11]，應(yīng)用CyclinD1的抑制劑或轉(zhuǎn)導(dǎo)入反義CyclinD1抑制其表達(dá)，可以使鱗癌停止生長(zhǎng)，腫瘤面積縮小和逐漸好轉(zhuǎn)[12]。

3.3 本研究PGP9.5與CyclinD1在Bowen病組織和皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，前者r=0.53，后者為r=0.44。表明PGP9.5與CyclinD1在Bowen病組織和皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織陽(yáng)性表達(dá)有相關(guān)性。說(shuō)明二者的相互作用在CSCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起一定作用。有作者[13]通過(guò)UVB誘導(dǎo)鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌的形成，證實(shí)CyclinD1在鱗癌組織中過(guò)表達(dá)，通過(guò)增加CyclinD1的泛素化，泛素-蛋白酶途徑增加CyclinD1的降解，可以減少鱗癌的發(fā)生。Anjali等[14]研究結(jié)果也支持PGP9.5通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，和增加細(xì)胞增殖、遷移促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的假設(shè)。最近的研究發(fā)現(xiàn)[15]，一種E3重要的連接酶: 包括FBX4盒蛋白質(zhì)晶體和aβ晶狀體蛋白的SCF復(fù)合體，其主要底物就是CyclinD1，而高表達(dá)的PGP9.5可能通過(guò)對(duì)CyclinD1的去泛素化，減少CyclinD1通過(guò)泛素-蛋白體通路的降解，使CyclinD1在細(xì)胞周期過(guò)表達(dá)，從而引起細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

3.4 通過(guò)對(duì)PGP9.5與CyclinD1的初步研究，提示二者在皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能起到一定的作用，而且PGP9.5的表達(dá)與腫瘤的病理分期密切相關(guān)，為腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的研究方向。但由于PGP9.5對(duì)許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用以及其在泛素-蛋白酶體途徑中的水解酶活性和連接酶活性作用，其過(guò)表達(dá)在CSCC腫瘤生長(zhǎng)途徑以及對(duì)其他實(shí)體鱗狀細(xì)胞癌的病理學(xué)機(jī)制上的研究，還須通過(guò)其對(duì)去泛素化下游區(qū)靶目標(biāo)作用的進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2011-10-25 [修回日期]2012-01-18

編輯/張惠娟