段惠生 張安盛 李麗莉 門(mén)興元 張思聰 周仙紅 于毅

摘要：西花薊馬是一種危險(xiǎn)性較強(qiáng)的外來(lái)入侵害蟲(chóng)，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)以及生物多樣性都造成了極大的損失和威脅。本文概述了分子標(biāo)記技術(shù)在西花薊馬的種類(lèi)鑒定、種群分化、原產(chǎn)地、傳播模式、檢測(cè)其捕食天敵的效能和攜帶番茄斑萎病毒(TSWV)等方面的應(yīng)用，并做了前景展望。

關(guān)鍵詞：西花薊馬；分子標(biāo)記；種類(lèi)鑒定；種群分化；傳播模式；TSWV

中圖分類(lèi)號(hào)：S433.89文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2012)01-0099-05

西花薊馬(Frankliniella occidentalis)屬纓翅目(Thysanoptera)、薊馬科(Thripidae)，是一種世界性入侵害蟲(chóng)。該蟲(chóng)原產(chǎn)于美國(guó)西部地區(qū)，自20世紀(jì)80年代后，迅速向外擴(kuò)散，2003年首次在北京發(fā)現(xiàn)，目前該蟲(chóng)分布遍及全球各大洲。在我國(guó)。北京、云南、浙江、山東、貴州和江蘇等省市都已有分布和為害的相關(guān)報(bào)道。西花薊馬具有極端多食性，不僅本身對(duì)農(nóng)作物危害極大，并且還可以傳播番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)等多屬的植物病毒，造成更嚴(yán)重的損失。西花薊馬不僅對(duì)世界經(jīng)濟(jì)造成了極大損失，而且對(duì)入侵地的生物多樣性構(gòu)成了巨大的威脅，因此各國(guó)學(xué)者對(duì)其早已展開(kāi)了多方面深入的研究。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，由于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了多種多樣的分子標(biāo)記技術(shù)。分子遺傳標(biāo)記突破了表達(dá)型標(biāo)記的局限性，其變異只來(lái)源于基因DNA序列的差異，具有穩(wěn)定性高、受環(huán)境條件的影響較小、信息含量高、不同層次和類(lèi)群之間廣泛可比等優(yōu)越性，因而成為遺傳標(biāo)記中又一強(qiáng)有力的工具，在揭示物種的遺傳變異性研究中發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。分子標(biāo)記的發(fā)展對(duì)西花薊馬的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

分子標(biāo)記技術(shù)目前已出現(xiàn)了幾十種，新的分子標(biāo)記還會(huì)不斷涌現(xiàn)。昆蟲(chóng)研究常用的一些分子標(biāo)記方法有，以Southern雜交為基礎(chǔ)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)和DNA指紋譜；以PCR為基礎(chǔ)的隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、DNA擴(kuò)增指紋分析(DNA amplification fingerprinting，DAF)、重復(fù)序列引物擴(kuò)增(simple repeat sequence primer-PCR，SRSP-PCR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(ampli-fied fragmemt length polymorphism，AFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(single-strand conformation poly-morphism-PCR，SSCP-PCR)；以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列即微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(simplesequence repeat，SSR)；以mRNA為基礎(chǔ)的mRNA差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(mRNA differential displayreverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)、DNA測(cè)序(DNA sequencing)以及單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)。本文概述了分子標(biāo)記技術(shù)在西花薊馬研究中的應(yīng)用情況，并對(duì)其應(yīng)用前景做了展望。

1.分子標(biāo)記在西花薊馬研究中的應(yīng)用

1.1西花薊馬分子鑒定的研究

西花薊馬是一種危險(xiǎn)性較強(qiáng)的外來(lái)人侵害蟲(chóng)，對(duì)于它的鑒定和分類(lèi)工作顯得尤為重要。西花薊馬的成蟲(chóng)在形態(tài)上具有明顯的特征，在顯微鏡下可以將其與其它近似種區(qū)別，但對(duì)于一些殘?bào)w、幼蟲(chóng)以及無(wú)法從形態(tài)上辨別的蟲(chóng)體，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速地鑒定。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這方面已經(jīng)做了大量的工作。Moritz等(2000)采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer，ITS)——限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(ITS-RFLP)的方法，成功地將西花薊馬和美棘薊馬(Echinothrips americanus Morgan)區(qū)分開(kāi)；Toda和Komazaki(2002)采用ITS2-RFLP法鑒別日本果樹(shù)上常見(jiàn)的9種薊馬(包括西花薊馬)的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)；Brunner等(2002)根據(jù)mtCO I-433bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)合測(cè)序和擴(kuò)增產(chǎn)物RFLP分析，有效區(qū)分了西花薊馬、煙薊馬(Thrips tabaciLindeman)和棕櫚薊馬(Thrips palmi Karny)；林峻賢等(2003)則基于28S rDNA和16S rDNA探討Multiplex-PCR及PCR-RFLP鑒定西花薊馬和煙薊馬的可行性。采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，游中華等(2007)對(duì)包括西花薊馬在內(nèi)的9種薊馬的mtDNA CO I基因片段(433bp)進(jìn)行了序列分析，準(zhǔn)確地檢測(cè)了各蟲(chóng)態(tài)的西花薊馬。

在田間的防治和檢驗(yàn)檢疫部門(mén)日常工作中時(shí)常會(huì)遇到有多種薊馬的樣本，這就需要用種特異PCR檢測(cè)(species-Specific PCR，SSP)。它是利用序列信息已知的DNA片段設(shè)計(jì)種特異引物進(jìn)而鑒定薊馬種類(lèi)。例如周力兵等(2007)利用Brunner等設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物mtDNA-7.2F和mtDNA-9.2R擴(kuò)增出了6種薊馬的mtDNA CO I基因片段，并且設(shè)計(jì)了西花薊馬特異性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，該兩對(duì)引物能夠?qū)⑽骰ㄋE馬的成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)、蛹同花薊馬(Fran-kliniella intonsa)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)、八節(jié)黃薊馬(Thrips flavidulus)、煙薊馬(Thripstabaci Lindeman)和大薊馬(Megalurothrips distal-is)5種薊馬區(qū)分。游中華(2008)通過(guò)對(duì)西花薊馬近緣種的15種薊馬的ITS2序列分析對(duì)比，設(shè)計(jì)了一對(duì)西花薊馬特異性引物YW-ITS2-F和YW-ITS2-F，該引物可以準(zhǔn)確地將西花薊馬與其它十幾種薊馬區(qū)分。孟祥欽等(2010)采用特征序列擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記技術(shù)獲得了對(duì)西花薊馬具有特異擴(kuò)增效果的引物1對(duì)(FOMF/FOMR)，該對(duì)引物不僅對(duì)不同蟲(chóng)態(tài)的西花薊馬具有擴(kuò)增能力，而且在西花薊馬發(fā)生地的寄主植物組織內(nèi)亦檢測(cè)到了其卵的存在。

由此可見(jiàn)，mtDNA CO I和rDNA ITS2基因序列是國(guó)內(nèi)外學(xué)者常用于研究西花薊馬分子鑒定的兩種分子標(biāo)記，這兩種分子標(biāo)記都有一定的保守性，又具有適當(dāng)?shù)淖儺惗?，同時(shí)運(yùn)用這兩種標(biāo)記的分子鑒定技術(shù)已經(jīng)十分成熟，操作簡(jiǎn)單，鑒定速度快，而且準(zhǔn)確，因此得到廣泛的研究應(yīng)用。

1.2西花薊馬種群分化的研究

種群分化是指同一生物群體在不同的生存環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，彼此之間出現(xiàn)了形態(tài)

上、行為上和生理上甚至遺傳上不同程度的差異，這種差異或大或小，表現(xiàn)為彼此遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。種群的分化，在更多的情況下，是潛在的遺傳差異，為進(jìn)一步的分化提供著遺傳多樣性的基礎(chǔ)。對(duì)于外來(lái)入侵害蟲(chóng)種群，如若在入侵地產(chǎn)生明顯的種群分化，那么將有可能導(dǎo)致該入侵害蟲(chóng)的大暴發(fā)。研究種群內(nèi)遺傳變異、種群間遺傳分化的過(guò)程及程度，對(duì)于理解物種的進(jìn)化趨勢(shì)以及種群動(dòng)態(tài)規(guī)律具有基礎(chǔ)性的意義，進(jìn)而對(duì)入侵害蟲(chóng)的治理起到重要指導(dǎo)作用。

目前，利用各種分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究昆蟲(chóng)種群遺傳分化已經(jīng)成為昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。武曉云等(2009)利用PCR技術(shù)克隆并分析了西花薊馬的rDNA ITS2和mtCO I基因5'末端的部分序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于rDNA ITS2變異程度較mtCO I基因大，因此mtCO I基因較rDNA ITS2更適合于西花薊馬的種內(nèi)遺傳分析；入侵我國(guó)的西花薊馬可能是由兩個(gè)(或多個(gè))株系或隱存種組成的復(fù)合體，并推測(cè)入侵我國(guó)的西花薊馬以溫室系(greenhouse strain)為主體，也存在一定數(shù)量的羽扇豆系(lupin strain)。Brunner等(2010)利用mtCO I基因和微衛(wèi)星分子標(biāo)記(SSR)技術(shù)對(duì)美國(guó)西部地區(qū)西花薊馬種群進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明在起源地西花薊馬種群發(fā)生了分化，發(fā)現(xiàn)這種遺傳分化與形態(tài)上的分化并不一致，并且討論了該地區(qū)的種群分化是由棲息地的環(huán)境不同(地理隔離)造成的。

用于該方面研究的分子標(biāo)記技術(shù)從先前的用mtCO I、rDNA ITS1、rDNA ITS2基因序列分析，到目前廣泛使用的SSR技術(shù)，兩種技術(shù)相互補(bǔ)充，能夠得到較為全面的結(jié)果。例如對(duì)我國(guó)的煙粉虱、美國(guó)白蛾以及蘋(píng)果綿蚜的研究。

1.3西花薊馬原產(chǎn)地及其傳播模式分析

西花薊馬原產(chǎn)于美國(guó)西部地區(qū)，后來(lái)隨著各國(guó)花卉業(yè)不斷發(fā)展，國(guó)際間貿(mào)易的頻繁逐步擴(kuò)散到世界各國(guó)。2000年，在我國(guó)昆明國(guó)際花卉節(jié)參展的緬甸盆景上首次截獲西花薊馬。目前我國(guó)的多個(gè)省份已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了西花薊馬，對(duì)我國(guó)的經(jīng)濟(jì)造成了一定的損失，對(duì)我國(guó)本土的生物多樣性也產(chǎn)生了威脅。研究我國(guó)西花薊馬的原產(chǎn)地及其傳播模式，對(duì)于重新構(gòu)建西花薊馬的入侵過(guò)程，及時(shí)尋找并引進(jìn)天敵，了解入侵初始種群大小及頻率，闡明生物在入侵過(guò)程中或入侵后的生物學(xué)變化，預(yù)測(cè)入侵物種的生物學(xué)特性以及借鑒有效的防治措施等具有重要的意義。

對(duì)于入侵種的原產(chǎn)地及其傳播模式的研究，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)無(wú)法做出準(zhǔn)確判斷，而利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，使這一入侵生態(tài)學(xué)問(wèn)題得到有效地解決。將我國(guó)的西花薊馬種群與國(guó)外各地區(qū)的種群進(jìn)行分子遺傳分化的對(duì)比分析，計(jì)算種群之間的遺傳距離，從而判斷親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。這方面運(yùn)用較多且研究較為成功的分子標(biāo)記技術(shù)是利用mtCO I基因和rDNA ITS2基因序列，例如，武曉云等(2009)采用mtCO I基因序列建樹(shù)分析云南、北京和哈爾濱的西花薊馬，推斷云南是西花薊馬最早入侵的地點(diǎn)，并且推測(cè)3個(gè)地區(qū)的西花薊馬可能是有相似的入侵來(lái)源。國(guó)內(nèi)也有成功運(yùn)用mtCO I分析種群分化的例子，如褚棟等(2005)基于mtDNA CO I對(duì)我國(guó)煙粉虱種群與國(guó)外煙粉虱種群進(jìn)行序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，我國(guó)廣大地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)的煙粉虱為B型煙粉虱，與美國(guó)西部地區(qū)以及以色列的煙粉虱具有極高的同源性；首次發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱入侵我國(guó)，而發(fā)現(xiàn)的Q型煙粉虱與西班牙、摩洛哥的Q型煙粉虱有極高同源性。

目前對(duì)于西花薊馬種群遺傳分析，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用，mtCO I和rDNA ITS2基因序列這兩種手段，但由于這兩種分子標(biāo)記相對(duì)保守，適合于分析遺傳分化較大的生物型或地理種群，對(duì)于研究更詳細(xì)的原產(chǎn)地分析則需要多態(tài)性更高的分子標(biāo)記，如SSR標(biāo)記。

1.4西花薊馬天敵的研究

目前西花薊馬僅在我國(guó)局部地區(qū)分布危害，而且由于其抗藥性強(qiáng)，利用本土天敵進(jìn)行生物防治是一項(xiàng)有效的措施。目前，西花薊馬的捕食性天敵種類(lèi)有30余種。國(guó)外利用且取得顯著成效的主要包括半翅目的蝽科和捕食螨。捕食性天敵對(duì)西花薊馬的控制效能是不一樣的，選擇出控制效能高的捕食陛天敵對(duì)于今后生物防治將起到關(guān)鍵性作用。

對(duì)于捕食者—獵物關(guān)系的研究，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法有多種，但卻有著部分捕食現(xiàn)象觀察難度大、室內(nèi)難以重建田間植被結(jié)構(gòu)和微環(huán)境、難以考慮多種因素的交互作用等局限性，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這方面的研究技術(shù)也就從形態(tài)學(xué)水平發(fā)展到了分子水平。利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠靈敏而特異地檢測(cè)捕食者體內(nèi)獵物殘?bào)w，從而準(zhǔn)確反映出捕食者對(duì)西花薊馬的捕食能力的大小。此方面研究應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)主要為兩類(lèi)：一類(lèi)是以蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的血清學(xué)抗體技術(shù)，一類(lèi)是以DNA為研究對(duì)象的分子標(biāo)記技術(shù)。前者常用的分子技術(shù)有聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)、多克隆抗體免疫檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附法、單克隆抗體技術(shù)；，后者常用的有RAPD、RFLP、SCAR、微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、DNA序列中的mtCO I、mtCOⅡ、rDNA ITS2以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR的體系內(nèi)加入熒光染料或帶有熒光染料標(biāo)記的探針，熒光信號(hào)隨著目的DNA的擴(kuò)增而增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)信號(hào)判斷目的DNA的數(shù)量，進(jìn)而鑒定標(biāo)本是否為靶標(biāo)種類(lèi)，如棕櫚薊馬、煙薊馬等。孟祥欽(2010)選取mtCO I為標(biāo)靶DNA，利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了9種西花薊馬的捕食性天敵，結(jié)果表明，捕食性天敵中東亞小花蝽的瞬時(shí)捕食能力最強(qiáng)，而異色瓢蟲(chóng)的捕食能力最低，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)利用CO I和SCAR分子標(biāo)記技術(shù)建立了本地天敵對(duì)西花薊馬捕食作用的定性檢測(cè)技術(shù)。

分子標(biāo)記在此方面的研究也是有缺陷的，它不能區(qū)分捕食與腐食、二級(jí)捕食，因此形態(tài)學(xué)方法同分子生物學(xué)方法應(yīng)結(jié)合運(yùn)用，發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)，從而使得西花薊馬天敵的研究能夠得到長(zhǎng)足發(fā)展。

1.5西花薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒(TSWV)的檢測(cè)

番茄斑萎病毒((Tomato spotted wilt virus，TSWV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒，其傳播介體為薊馬。薊馬由若蟲(chóng)在病株上取食獲毒，成蟲(chóng)不能獲毒，但能夠?qū)Ｒ恍缘匾猿志眯缘姆绞絺鞑?，即薊馬一旦獲毒終身能夠傳毒。西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要也是最有效的傳播介體。近年來(lái)，隨著西花薊馬的不斷擴(kuò)散，番茄斑萎病毒也在全世界不斷地?cái)U(kuò)散傳播，造成世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失不斷加重。因此，各國(guó)學(xué)者逐步重視對(duì)西花薊馬攜帶的番茄斑萎病毒的研究。雖然西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要的傳播介體，但并不是每個(gè)西花薊馬個(gè)體中都攜帶有番茄斑萎病毒，因此檢測(cè)某地區(qū)的西花薊馬體內(nèi)是否有番茄斑萎病毒顯得尤為關(guān)鍵。

檢測(cè)薊馬體內(nèi)的番茄斑萎病毒的方法有很多，像ELISA、電鏡觀察、核酸圓點(diǎn)印跡法以及免疫壓片印跡法。但這些方法在處理高通量的樣本時(shí)都存在不同的缺陷，電鏡觀察過(guò)于耗費(fèi)時(shí)間，ELISA因?yàn)闆](méi)有結(jié)構(gòu)性蛋白而靈敏度較差，免疫壓片印跡法在問(wèn)題的解釋上有一定的困難；除此之外，在ELISA和免疫壓片印跡法都會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象。

TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)是常用于檢測(cè)薊馬體內(nèi)病毒的分子標(biāo)記技術(shù)，它免去了PCR后續(xù)的檢測(cè)步驟，縮短了操作時(shí)間，顯著降低了PCR后操作污染的可能性，而且靈敏度更高，可以更加快速、高通量的檢測(cè)樣品，同時(shí)由于它是定量的，能夠檢測(cè)病毒與薊馬間的交互作用。Boonham以西花薊馬的核RNA為標(biāo)靶，初步探討了利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR探針檢測(cè)西花薊馬體內(nèi)是否攜帶番茄斑萎病毒的可能性，結(jié)果表明，這種方法不僅可以檢測(cè)單頭的個(gè)體，同時(shí)也適合應(yīng)用于大通量的樣品檢測(cè)。

2.小結(jié)與展望

從上述事例來(lái)看，目前分子標(biāo)記技術(shù)以其靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用在西花薊馬的研究中，極大地?cái)U(kuò)展了西花薊馬研究領(lǐng)域，豐富了研究手段。分子標(biāo)記技術(shù)種類(lèi)繁多，而且每種技術(shù)本身都有優(yōu)缺點(diǎn)，因此在應(yīng)用的同時(shí)應(yīng)該綜合利弊，選取合適的標(biāo)記技術(shù)，以達(dá)到靈敏而準(zhǔn)確的目的，以免造成不必要的浪費(fèi)。

西花薊馬是一種危險(xiǎn)性外來(lái)入侵害蟲(chóng)，它的入侵機(jī)制、傳播模式等人侵生態(tài)學(xué)問(wèn)題是需要我們重點(diǎn)關(guān)注的。利用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)研究西花薊馬的生物適應(yīng)、競(jìng)爭(zhēng)等成功入侵因素，成為未來(lái)我們研究西花薊馬的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是一個(gè)重要的突破口。國(guó)外對(duì)西花薊馬的研究起步早，研究范圍廣，但我國(guó)對(duì)西花薊馬的研究起步較晚，最早的報(bào)道始于2000年。為防止西花薊馬對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成的損失不斷加劇，我們?cè)诶^續(xù)深入地研究西花薊馬的同時(shí)，不斷地開(kāi)發(fā)新的技術(shù)手段，從而更好地為將來(lái)的研究服務(wù)。煙粉虱也是一種世界性的入侵害蟲(chóng)，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)造成過(guò)重大損失，目前各國(guó)對(duì)其研究已經(jīng)十分深入而卓有成效，從其生物學(xué)特性研究到入侵生態(tài)學(xué)研究，分子標(biāo)記技術(shù)起到了關(guān)鍵性作用。對(duì)于西花薊馬的研究，筆者認(rèn)為可以以煙粉虱研究為模板，結(jié)合西花薊馬本身特性以及相關(guān)的分子標(biāo)記，繼續(xù)深入展開(kāi)研究。