楊喜明,李明

[摘要]目的：探討核因子κB在燒傷血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、20%（V/V）人燒傷血清刺激組、PDTC預(yù)處理組, 1h后采用MTT及流式細(xì)胞儀觀察HUVECs損傷情況，蛋白印跡法檢測HUVECs胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，燒傷血清誘導(dǎo)了HUVECs損傷和凋亡，胞核NF-κB-p65蛋白表達(dá)增多。相對(duì)于燒傷血清刺激組，PDTC預(yù)處理組HUVECs損傷減輕，細(xì)胞凋亡顯著減少。結(jié)論：核因子κB參與燒傷血清致內(nèi)皮細(xì)胞損傷, 阻斷核因子κB可能對(duì)防治嚴(yán)重?zé)齻碌膬?nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定潛在價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]燒傷；內(nèi)皮細(xì)胞；核因子κB

[中圖分類號(hào)]R644Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）01-0066-02

NF-κB imvolved in the process of vascular endothelial cells damage caused by burn sera

YANG Xi-ming,LI Ming

(Department of Burn,Affiliated Hospital,Yan'an University,Yan'an 716000, Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the role of NF-κB in the vascular endothelial cells damage by burn sera.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in vitro and randomly divided into 3 groups: 5% fetal bovine serum group; 20% burn human serum group and pretreated with PDTC group. The injury and apoptosis of HUVECs were observed after 1 hours by MTT and flow cytometry. Meanwhile, the content of NF-κB-p65 in the nucleus were detected by wester blotting.ResultsCompared with the 5% fetal bovine serum group, burn serum could induce the injury and apoptosi of HUVECs, up-regulate the protein expressions of NF-κB-p65 in the nucleus. Compared with the 20% burn human serum group, the injury and apoptosis of HUVECs was significantly improved in pretreated with PDTC group.ConclusionsNF-κB is involved in the procedure of HUVECs damage caused by burn serum. It may benefit the HUVECs by blocking NF-κB in severe burn patients.

Key words:burn;endothelial cell;NF-κB

嚴(yán)重?zé)齻缙谘軆?nèi)皮細(xì)胞損傷，不僅造成血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的損害，還嚴(yán)重消弱了內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板黏附和聚集、抑制血管平滑肌增殖、維持機(jī)體凝血纖溶系統(tǒng)平衡及維持血管通透性等方面發(fā)揮的重要作用，從而成為燒傷早期休克發(fā)生和多臟器受累的基礎(chǔ)[1]。核因子κB廣泛參與多種細(xì)胞的生理、病理過程, 許多研究提示核因子κB參與多種心血管事件[2]，因此深入探討核因子κB在燒傷血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用對(duì)于研究燒傷早期抗休克及多臟器保護(hù)具有重要意義。

1材料和方法

1.1材料：胰島素（丹麥 Novo Nordisk公司）；內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（美國 Sciencell公司）；NF-κB-p65(美國 Cell Signaling公司)； 兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京 中衫金橋公司）；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(南京 凱基公司)；NF-κB特異抑制劑 PDTC（美國 Sigma公司）；Western-Blot系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司）；ChemiDoc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分離培養(yǎng)：在知情同意下獲得健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后的新鮮臍帶（離體時(shí)間≤6h），長度約20cm。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS)灌洗臍靜脈至流出液清亮后將1%Ⅱ型膠原酶注入靜脈腔，37℃孵育15min，收集消化液，離心沉淀細(xì)胞。用含5%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和95%的O2條件下培養(yǎng)，每3～5天傳代一次，第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用鏡下形態(tài)觀察及Ⅷ因子免疫組化染色對(duì)HUVECs進(jìn)行鑒定。

1.2.2 燒傷血清收集：在知情同意下選擇筆者單位燒傷患者9例（男8、女l例），年齡l8～50歲，燒傷面積≥50%（其中Ⅲ度面積≥30%TBSA）。抽取傷后正規(guī)抗休克治療前24 h之內(nèi)靜脈血各10ml，低溫離心取上清。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)分為3組：（A）空白對(duì)照組：不加任何刺激因素常規(guī)培養(yǎng)；（B）燒傷血清刺激組: 用含20%（V/V）燒傷血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；（C）PDTC預(yù)處理組:于培養(yǎng)基中加入核因子κB特異抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽 (PDTC,50mmol/L)預(yù)處理 30min后, 施加燒傷血清刺激。各組孵育1h后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 MTT法檢測細(xì)胞活力：細(xì)胞接種于96孔板，燒傷血清刺激1h，按培養(yǎng)基的1/10比例加入 MTT(5mg/ml),37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清。加入定量二甲亞砜, 振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。490nm波長分光光度計(jì)測定兩組OD490值(空白對(duì)照為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，空白孔調(diào)零)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：棄去培養(yǎng)液，用0.125% 胰酶消化，離心收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液（5×105個(gè)/ml）后行膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（annexin V/PI）雙染，于流式細(xì)胞儀上采用15mW 氬離子激光，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射波長為530nm，行定量分析，計(jì)算annexin V/PI雙染陽性細(xì)胞百分含量。

1.3.3 蛋白印跡法（Western-Blot）檢測相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平：棄去培養(yǎng)液，用0.125% 胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按試劑盒步驟依次提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白, 4，4′-二羧酸-2，2′-二喹啉法測定細(xì)胞總蛋白濃度。取等量樣本行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜與一抗在4℃共同孵育過夜，漂洗后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共同孵育，在暗室中化學(xué)發(fā)光后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以 x±s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析, 以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 傳代后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h內(nèi)全部貼壁,細(xì)胞呈多角形或鵝卵石狀，臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活力,活細(xì)胞比率大于95%；Ⅷ因子免疫組化染色,鏡下可見98%以上細(xì)胞染色呈陽性。

2.2 MTT細(xì)胞活力檢測 刺激1 h后采用MTT法檢測細(xì)胞活力。A組細(xì)胞OD 值為（0.152±0.011）。與A組相比，B組（0.121±0.010）細(xì)胞活力降低（P<0.05），C組（0.143±0.012）其OD值較B組明顯升高（P<0.05）, 心肌細(xì)胞活力提高。

2.3 流式細(xì)胞儀凋亡檢測A組細(xì)胞凋亡率為（13.7±2.2）%。與A組相比，B組（34.5±2.3）%細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P<0.01）。與B組相比，C組（21.9±2.5）% 細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。

2.4細(xì)胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)水平 A組細(xì)胞胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)水平較低。與A組相比，B組細(xì)胞胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)水平明顯升高。與B組相比，C組細(xì)胞胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)水平明顯減少。見圖1。

3 討論

核轉(zhuǎn)錄因子指一類能和某些特定基因啟動(dòng)子區(qū)固定核苷酸序列結(jié)合從而啟動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。NF-κB 是其中一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，也是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、炎癥、細(xì)胞再生、凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。NF-κB由p50和p65亞基形成二聚體，在靜息狀態(tài)下，NF-κB與κB抑制蛋白IκB（以IκB-α最為重要）結(jié)合以無活性方式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)（如腫瘤壞死因子α、脂多糖、氧化劑、蛋白激酶激活劑等），IκB發(fā)生磷酸化而降解，使NF-κB與其解離并迅速發(fā)生核移位，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[4]。嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙谘逯卸喾N炎癥因子普遍升高，已有研究報(bào)道NF-κB信號(hào)通路是燒傷血清刺激下內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能紊亂的中心環(huán)節(jié)之一[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞胞核幾乎無NF-κB陽性表達(dá)，燒傷血清刺激1h后細(xì)胞胞核NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，與其變化趨勢相一致的是內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯、細(xì)胞凋亡顯著增加；而給予NF-κB特異性阻斷劑預(yù)處理，伴隨著燒傷血清刺激后細(xì)胞胞核NF-κB表達(dá)回落，內(nèi)皮細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡也顯著減輕。說明內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB在燒傷血清誘導(dǎo)下發(fā)生明顯核移位并可能在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中扮演重要角色。

防治嚴(yán)重?zé)齻髢?nèi)皮細(xì)胞損傷, 維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定一直是燒傷防治的一個(gè)重點(diǎn)。本研究初步證實(shí)NF-κB參與嚴(yán)重?zé)齻髢?nèi)皮細(xì)胞損傷, 因此，采取阻斷NF-κB的策略對(duì)于防治嚴(yán)重?zé)齻髢?nèi)皮損傷可能具有一定的潛在意義, 深入探索具有靶細(xì)胞特異性和對(duì)不同NF-κB成員具有選擇性的細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化阻斷劑，可能是防治嚴(yán)重?zé)齻髢?nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的一個(gè)重要方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]楊宗城. 燒傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其在早期臟器損害中的作用[J].中華燒傷雜志,2001,17(3): 133-135.

[2]Chen XL,Xia ZF,Wei D, et al. Expression and regulation of vascular cell adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by sera from severely burned patients[J].Crit Care Med, 2004, 32 (1): 77-82.

[3]Mankan AK, Lawless MW, Gray SG, et al. NF-kappaB regulation: the nuclear response[J].J Cell Mol Med, 2009, 13 (4):631-643.

[4]Hayden MS, Ghosh S. Shared principles in NF-kappaB signaling[J].Cell, 2008, 132 (3):344-362.

[5]朱桂英,張捷,蔡景龍. NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在瘢痕疙瘩中的異常表達(dá)[J].中國美容醫(yī)學(xué),2008,17 (11):1631-1634.

[收稿日期]2011-08-19[修回日期]2011-10-25

編輯/張惠娟