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[摘要]目的：探討VEGF在不同皮膚擴張方式中的表達與擴張皮瓣中新生血管的形成關(guān)系，建立適合于臨床的最佳的皮膚擴張方式。方法：選用62只新西蘭大白兔隨機分為5大組，隨機將動物按不同擴張方式分為5組：A組（反復(fù)快速擴張組）、B組（快速擴張組）、C組（常規(guī)擴張組）、D組（植入不擴組）、E組（正常對照組），采用免疫組織化學(xué)染色觀察擴張皮瓣中VEGF的表達情況。結(jié)果：在維持1周，A組的VEGF表達明顯高于B組和C組（P<0.05），B組與C組差異不明顯（P>0.05）；在維持2、3、4周A組與B組、C組比較均無顯著性差異（P>0.05）；在維持6周，A組的VEGF表達與B組比較無顯著性差異（P>0.05）；維持6周的A組和B組的VEGF表達明顯高于維持4周的C組（P<0.05）。結(jié)論：反復(fù)快速皮膚擴張可明顯提高擴張皮瓣中VEGF的合成與分泌，促進血管形成。

[關(guān)鍵詞]皮膚擴張術(shù)；血管生成；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

[中圖分類號]R622R332[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

目前皮膚軟組織擴張術(shù)已廣泛應(yīng)用于整形外科中[1-6]，成為整形外科的重要治療手段和常用的基本技術(shù)。臨床上應(yīng)用最多的擴張方式為常規(guī)擴張方式。但此法療程較長、并發(fā)癥多[7-12]。國內(nèi)外學(xué)者對此發(fā)展了各種快速擴張方式[13-16]，這些方法均不同程度上縮短了療程，但可能導(dǎo)致組織壞死，還存在諸如回縮率較高、操作繁瑣、設(shè)備昂貴等弊端。近年微創(chuàng)技術(shù)的出現(xiàn)有效減少了并發(fā)癥[17]。本研究結(jié)合目前臨床常用的常規(guī)擴張法與快速擴張法的特點，擬采用一種新型的皮膚軟組織擴張方式-反復(fù)快速皮膚擴張，通過對新西蘭大白兔皮膚擴張，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法，觀察反復(fù)快速皮膚擴張對皮瓣血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的影響，并探討建立更適應(yīng)于臨床的皮膚擴張方式提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實驗動物：62只雄性新西蘭大白兔，6月齡，體重2～3kg，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，冀醫(yī)動管字610063號。動物分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飼料，自由飲食。

1.2 動物分組：隨機將動物按不同擴張方式分為5組：A組（反復(fù)快速擴張組）、B組（快速擴張組）、C組（常規(guī)擴張組）、D組（植入不擴組）、E組（正常對照組），A、B組每組20只動物，C組16只動物，D組5只動物，E組1只動物。

1.3 皮膚擴張動物模型制備：手術(shù)區(qū)備皮，術(shù)前稱量體重，2.5g/L戊巴比妥鈉（25mg/Kg）于耳緣靜脈注射行全身麻醉。麻醉顯效后，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)、鋪無菌巾。自兩耳根后緣連線間，橫行切開長約2.5cm皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，血管鉗向前鈍性分離頭部皮膚與顱骨骨膜的疏松附著，分離范圍：兩側(cè)近眶骨上緣1cm，前部距鼻翼2cm處。自皮膚切口處，于植入腔內(nèi)植入容量為50ml的腎形擴張器，上海東月醫(yī)療保健用品有限公司產(chǎn)，產(chǎn)品批號：050301。植入前自注射壺注射無菌生理鹽水檢查擴張器有無滲漏。注射壺埋入頸部皮下，嚴密縫合皮膚切口。自注射壺注入無菌生理鹽水5ml。術(shù)畢即刻肌肉注射慶大霉素8萬單位，術(shù)后每日肌肉注射慶大霉素8萬單位至術(shù)后3天。擴張器植入術(shù)后第3天開始擴張皮膚（見圖1）。

1.3.1 A組：每日擴張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水20ml， 維持30min；然后抽出全部注入液體，間隔3h；照上述方法反復(fù)3次，最后一次抽出15ml液體，擴張器內(nèi)留置5ml無菌生理鹽水。每日重復(fù)上述步驟，10日完成注水。

1.3.2 B組：每日擴張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水5ml，10日完成注水。

1.3.3 C組：每3日擴張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水5ml，28日完成注水。

1.4 標本采集與處理：A、B組分別于擴張完成后維持1周、2周、3周、4周、6周；C組分別于擴張完成后維持1周、2周、3周、4周隨機抽取4只動物留取標本。D組分別于植入擴張器后1周、2周、3周、4周、6周隨機抽取1只動物留取標本。修剪表面毛發(fā)后，全麻下于擴張皮瓣中央處切取約1cm×1cm大小的擴張全層皮膚組織塊。投入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm連續(xù)切片。進行VEGF免疫組織化學(xué)觀察。

1.5 VEGF陽性判定標準：VEGF表達主要見于細胞漿內(nèi)，表現(xiàn)為棕黃色顆?；螯S褐色顆粒分布于胞漿中。VEGF陽性表達以胞漿胞膜有棕黃色顆粒為準。VEGF在上皮細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞均有表達。

1.6 VEGF含量的判定：采用計算機自動圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下（200×）沿皮膚紋路隨機選取5個不同的皮膚組織區(qū)域，測定其陽性細胞所占比例，以陽性細胞染色的積分光度值（integrated optical density， IOD）來表示抗原表達量。陽性染色的積分光度越高，說明陽性細胞數(shù)量越多。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理：VEGF計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）來表示，運用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 一般情況：動物實驗過程中，所有實驗動物未出現(xiàn)感染、擴張器外露、皮瓣壞死等并發(fā)癥，均成活到預(yù)定觀察時間。

2.2HE染色組織學(xué)觀察：A、B、C組：維持1、2周時，微血管明顯增生，排列密集，管腔較小，圓形或類圓形，主要集中于真皮乳頭層、網(wǎng)狀層以及毛囊周圍；維持4周時，血管數(shù)量較多，排列較密集，管腔較大。

D組：血管增生不明顯，管腔明顯，排列比較稀疏，可見一些小血管稀疏排列在真皮淺層、網(wǎng)狀層和毛囊周圍。

2.3VEGF的表達：VEGF的染色特點：VEGF的陽性定位于細胞的胞漿，反應(yīng)物質(zhì)呈黃色顆粒狀，表達較強時為棕黃色。VEGF主要表達于上皮細胞，成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞亦可以見陽性染色，在毛囊細胞及皮脂腺細胞也可見表達（見圖2～3）。

A、B、C三組在維持1周VEGF的表達均處于較高水平（見圖4），隨著維持時間的延長，VEGF的表達呈下降趨勢，在維持4周時（見圖5），VEGF的表達接近正常皮膚的水平，而后再次升高（表1）。

在維持1周，A組的VEGF表達明顯高于B組和C組（P<0.05），B組與C組差異不明顯（P>0.05）；在維持2、3、4周，A組與B組、C組比較均無顯著性差異（P>0.05）；在維持6周，A組的VEGF表達與B組比較無顯著性差異（P>0.05）；維持6周的A組、B組VEGF表達明顯高于維持4周的C組（P<0.05）（表2）。

3討論

3.1 VEGF也稱血管通透性因子（vascular permeability factor， VPF）或促血管素，最初是由培養(yǎng)的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的一種新型生長因子，能增加微小血管通透性。隨后發(fā)現(xiàn)該因子能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，并促進其增殖，因此命名為VEGF。VFGF通過和血管內(nèi)皮細胞的特異性受體結(jié)合，具有促內(nèi)皮增殖、促血管生成作用，其它血管生成因子的血管生成作用是全部或部分通過增強VFGF的表達及生成作用實現(xiàn)的。VFGF的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在兩方面：增加微血管的通透性和特異性的與血管內(nèi)皮細胞受體結(jié)合，促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和增殖進而導(dǎo)致新生血管的生成。

3.2 擴張后擴張皮膚微血管的變化是一個復(fù)雜的過程，受內(nèi)皮細胞生長因子等多種血管活性因子的影響。早期研究表明在擴張的組織中細胞活性增加[18-19]。擴張時增加了皮膚局部缺血、缺氧程度[18，20-21]，局部缺血造成VEGF的合成、分泌增加。皮膚擴張除可產(chǎn)生額外的皮膚組織，且能明顯促進血管增生。Lantieri等[22]采用免疫組織化學(xué)方法，首次發(fā)現(xiàn)擴張皮膚組織內(nèi)VEGF表達增多，在真皮淺層、毛囊及皮脂腺均可見強烈表達，證明在組織擴張時局部缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF可能是組織擴張中血管發(fā)生的一個機制。

3.3 本實驗研究發(fā)現(xiàn)，皮膚組織在受到擴張刺激后，VEGF合成與釋放增加，三種擴張方式均可造成擴張皮膚組織中VEGF的高表達。三組擴張皮膚組織中VEGF的高表達在維持前期保持在較高水平，在維持期2周時表現(xiàn)為急速下降趨勢，以后呈平穩(wěn)下降趨勢，在維持期4周時，VEGF的表達下降至正常水平?？赡艿脑颍洪L期的缺血、缺氧致細胞的代償性活性增強，VEGF合成、分泌增加，至維持期第2周時，失代償后細胞凋亡，VEGF合成、分泌減少；造成VEGF的表達在維持期2周時的急速下降趨勢。折線圖中顯示反復(fù)快速擴張組的VEGF表達高于快速擴張組和常規(guī)擴張組。表明：反復(fù)快速擴張的刺激，增加了組織細胞的活性，促進了VEGF合成、分泌的增加，而VEGF分泌的增加，又進一步促進了內(nèi)皮細胞增殖，促使擴張皮瓣中血管增生。隨著維持時間的延長，局部缺血、缺氧程度逐漸減輕，VEGF的表達趨于正常水平。

[參考文獻]

[1]Xiaobo Y， Haiyue J， Hongxing Z， et al. Post-traumatic ear recontruction using postauricular fascial combined with expanded skin flap[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2011， 64（9）：1145-1151.

[2]Crosby MA，Dong W，F(xiàn)eng L，et al. Effect of intraoperative saline fill volume on perioperative outcomes in tissue expander breast reconstruction[J].Plast Reconstr Surg.2011，127（3）：1065-1072.

[3]Chummun S，Addison P， Stewart KJ. The osmotic tissue expander： a 5-year experience[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2010，63（12）：2128-2132.

[4]Marquardt C， B？lke E， Gerber PA，et al. Correlation of cutaneous tension distribution and tissue oxygenation with acute external tissue expansion[J].Eur J Med Res，2009，14（11）：480-486.

[5]Dotan L， Icekson M， Yanko-Arzi R，et al. Pediatric tissue expansion： our experience with 103 expanded flap reconstructive procedures in 41 children[J]. Isr Med Assoc J，2009，11（8）：474-479.

[6]Spence RJ.An algorithm for total and subtotal facial reconstruction using an expanded transposition flap： a 20-year experience[J].Plast Reconstr Surg，2008，121（3）：795-805.

[7]Gladstone HB， Stewart D.An algorithm for the reconstruction of complex facial defects[J].Skin Therapy Lett.2007，12（2）：6-9.

[8]范金財，張卓男，陳玉剛，等.人體組織擴張器非感染性并發(fā)癥相關(guān)細菌學(xué)分析研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（2）：151-152

[9]周曉力，邱明晰，許慶建，等.應(yīng)用皮膚軟組織擴張器出現(xiàn)并發(fā)癥原因分析[J].組織工程與重建外科雜志，2008，14（1）：18.

[10]王美水，王彪，莊福連，等.間斷擴張術(shù)和持續(xù)注水?dāng)U張術(shù)并發(fā)癥的比較分析[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（9）：1212-1213.

[11]李海東，蔡國斌，李斌斌，等.胸腹部埋置擴張器并發(fā)癥的分析與處理[J].中國美容整形外科雜志，2007，18（1）：46-48.

[12]Adler N， Dorafshar AH， Bauer BS， et al.Tissue expander infections in pediatric patients： management and outcomes[J].Plast Reconstr Surg，2009，124（2）：484-489.

[13]Marks MW， Mackenzie JR， Burney RE，et al.Response of random skin flaps to rapid expansion[J].J Trauma.1985，25（10）：947-952.

[14]Schmidt SC， Logan SE， Hayden JM， et al.Continuous versus conventional tissue expansion： experimental verification of a new technique[J].Plast Reconstr Surg，1991，87（1）：10-15.

[15]Mustoe TA， Bartell TH， Garner WL.Physical， biomechanical， histologic， and biochemical effects of rapid versus conventional tissue expansion[J].Plast Reconstr Surg， 1989，83（4）：687-691.

[16]Iwahira Y， Maruyama Y.Combined tissue expansion： clinical attempt to decrease pain and shorten placement time[J].Plast Reconstr Surg，1993，91（3）：408-415.

[17]Egeland BM， Cederna PS.A minimally invasive approach to the placement of tissue expanders[J].Semin Plast Surg，2008，22（1）：9-17.

[18]Argenta LC， Marks MW， Pasyk KA. Advances in tissue expansion[J].Clin Plast Surg， 1985， 12（2）：159-171.

[19]Austad ED， Pasyk KA， McClatchey KD，et al. Histomorphologic evaluation of guinea pig skin and soft tissue after controlled tissue expansion[J].Plast Reconstr Surg，1982， 70（6）：704-710.

[20]Marks MW， Burney RE， Mackenzie JR， et al.Enhanced capillary blood flow in rapidly expanded random pattern flaps[J].J Trauma， 1986， 26（10）：913-915.

[21]Banai S， Shweiki D， Pinson A， et al.Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced bymyocardial ischaemia：Implications for coronary angiogenesis[J].Cardiovasc Res， 1994， 28（8）：1176-1179.

22]Lantieri LA， Martin Garcia N， Wechsler J， et al. Vascular endothelial growth factor expression in expanded tissue：a possible mechanism of angiogenesis in tissue expansion[J].Plast Reconstr Surg， 1998， 101（2）：392-398.

[收稿日期]2012-06-28[修回日期]2012-08-27

編輯/張惠娟