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        后溝堡子酒酒曲優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的初步分離與鑒定

        2012-04-29 09:24:01趙文婧石瑛王瑞祥單樹花
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年20期
        關(guān)鍵詞:分離大曲細(xì)菌

        趙文婧 石瑛 王瑞祥 單樹花

        摘要:從山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒曲樣品中初步分離純化出2株細(xì)菌XJ1和XJ2,通過形態(tài)觀察以及生理生化反應(yīng)分析得出,XJ1白色、中等大小、圓形、菌落呈放射狀,XJ2呈乳白色、形狀規(guī)則、表面呈粉末狀、較致密。通過生理生化試驗(yàn)得出,兩株細(xì)菌的吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)同呈陽性,兩株細(xì)菌均能利用葡萄糖和半乳糖,均不能利用蔗糖,XJ1革蘭氏染色呈陽性,XJ2革蘭氏染色呈陰性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可以得出這兩株菌株分別是乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬。

        關(guān)鍵詞:堡子酒;大曲;細(xì)菌;分離

        中圖分類號(hào):Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)20-4604-03

        酒類是中國第一大類發(fā)酵食品,現(xiàn)在人們視高度白酒為慎用食品,而低度、開胃助消化、營養(yǎng)豐富且具有保健功能的釀造酒已成為人們追求的目標(biāo)。用曲釀酒是中國酒的特色,在世界釀酒史上獨(dú)樹一幟,是中國的一項(xiàng)偉大發(fā)明[1]。日本著名釀酒專家板口謹(jǐn)一郎先生曾經(jīng)評(píng)論,中國發(fā)明酒曲釀酒,其影響之大,堪與中國四大發(fā)明相比[2]。在現(xiàn)代大致將酒曲分為五大類,麥曲、小曲、紅曲、大曲、麩曲,分別用于制作不同的酒。探索酒曲發(fā)酵的奧妙,從而揭示其釀酒發(fā)酵機(jī)理,以利于更有效地指導(dǎo)生產(chǎn),進(jìn)行質(zhì)量控制,改良酒體風(fēng)格[3]。

        縱觀世界各國的釀酒史發(fā)現(xiàn),用谷物原料釀酒的技術(shù)主要有兩大類,一類是以谷物發(fā)芽的方式,利用谷物發(fā)芽時(shí)產(chǎn)生的酶將原料本身糖化成糖分,再用酵母菌將糖分轉(zhuǎn)變成酒精;另一類是用發(fā)霉的谷物制成酒曲,用酒曲中所含的酶制劑將谷物原料糖化發(fā)酵成酒。傳統(tǒng)的酒曲本質(zhì)之一就是粗酶制劑,但傳統(tǒng)的酒曲的最大缺點(diǎn)是酶活較低。在現(xiàn)代由于酶制劑工業(yè)的發(fā)展,在酒的生產(chǎn)過程中適當(dāng)加入一部分酶制劑以代替部分傳統(tǒng)酶制劑的使用可降低酒的生產(chǎn)成本,但所產(chǎn)生的問題是酒的香味受到一定的影響。

        白酒生產(chǎn)微生物是影響產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)格的重要因素之一,不同區(qū)域的地理環(huán)境存在眾多不同的微生物菌群。淡雅濃香型白酒應(yīng)有己酸乙酯為主的復(fù)合香氣,凸顯幽雅飄逸感,口味應(yīng)努力做到綿柔、醇和、回甜、爽凈,具有舒適感;在風(fēng)格上注重色、香、味的自然諧調(diào)感,具有獨(dú)特淡雅的風(fēng)格。白酒生產(chǎn)技術(shù)是中國勞動(dòng)人民和科學(xué)工作者對(duì)世界釀酒工業(yè)的特殊貢獻(xiàn)。其獨(dú)特的多種微生物固態(tài)發(fā)酵釀酒、甑桶蒸餾及其生產(chǎn)工藝形成了白酒的各種風(fēng)格[4]。白酒的特殊風(fēng)味來源于參與白酒發(fā)酵的微生物種類和數(shù)量的多寡,謂之“曲者,酒之骨也?!贬劸圃显谖⑸锏淖饔孟律筛鞣N呈香味物質(zhì),所以微生物的種類又是關(guān)鍵因素。由于微生物之間存在著互生、共生、寄生、拮抗的關(guān)系,在白酒生產(chǎn)過程中逐漸形成一個(gè)靠自然給予、異常復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系。這種區(qū)系的存在在很大程度上決定白酒的風(fēng)格。

        本研究采用的酒曲樣品來源于山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒廠。該酒廠以當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的高粱為主料,谷糠為輔料,大麥、豌豆踩制的大曲為糖化發(fā)酵劑,利用地缸固體分離發(fā)酵和清蒸二次傳統(tǒng)工藝進(jìn)行釀造,釀制出了原有風(fēng)味的堡子酒。大曲中含有細(xì)菌、霉菌、酵母菌等多種微生物,因此發(fā)酵過程極為復(fù)雜,各種微生物的生理性能不同,其作用也各異。探討堡子酒酒曲中細(xì)菌的生化活性,通過微生物平板分離純化技術(shù),采用稀釋、涂布、恒溫培養(yǎng)、生理生化等試驗(yàn),對(duì)酒曲中的細(xì)菌進(jìn)行初步分離鑒定,從而揭示堡子酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌種類,為優(yōu)化酒質(zhì)量,改善酒質(zhì),提高堡子酒營養(yǎng)價(jià)值,開發(fā)堡子酒系列新品種提供參考。

        對(duì)于國內(nèi)研究酒曲細(xì)菌分離和鑒定的試驗(yàn)來說,堡子酒的研究屬于首例,對(duì)于堡子酒本身來說填補(bǔ)了其空白,為堡子酒品質(zhì)的提高提供依據(jù);另一方面堡子酒屬于清香型白酒,它和汾酒同屬一個(gè)系列,該項(xiàng)研究提升堡子酒本身價(jià)值的同時(shí),也為國內(nèi)清香型白酒的研究做了一定的補(bǔ)充。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1原料后溝堡子酒酒曲由山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒廠提供。

        1.1.2儀器與設(shè)備海爾HRCJ-2D型無菌操作臺(tái)、海爾HRSP-250H型恒溫培養(yǎng)箱和海爾搖床購自上海富眾生物科學(xué)有限公司,CL-32L型滅菌鍋購自日本ALP,MP4002型電子天平購自上海恒平科學(xué)儀器有限公司,H5-1型磁力加熱攪拌器購自鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司。酒精燈、接種環(huán)、研缽、紗布、棉花、繩子、三角玻璃棒、1 000 mL燒杯、中號(hào)試管、9 cm培養(yǎng)皿、500 mL錐形瓶、1 mL移液管、玻璃珠、德漢氏小管。

        1.1.3試劑牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蔗糖、半乳糖、淀粉、甲基紅、乙醚、對(duì)甲基苯甲醛、濃鹽酸、溴甲酚紫、無水乙醇、95%乙醇、碘化鉀、碘均為分析純。

        1.1.4固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15~20 g,用去離子水定容到1 000 mL,pH 7.4~7.6;淀粉培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、可溶性淀粉2 g、氯化鈉

        5 g、瓊脂15~20 g、牛肉膏5 g,用去離子水定容至

        1 000 mL,pH 7.2;糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、半乳糖10 g、16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液1 mL,用去離子水定容到

        1 000 mL,pH 7.4;吲哚培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、氯化鈉

        5 g,用去離子水定容到1 000 mL,pH 7.6;甲基紅(MR)培養(yǎng)基:蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀5 g、葡萄糖

        5 g,用去離子水定容到1 000 mL,pH 7.2~7.4;蛋白胨水培養(yǎng)基:蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g,用去離子水定容到100 mL,pH 7.8;葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基:葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g,用去離子水定容到100 mL,pH 7.2~7.4。

        1.2方法

        1.2.1細(xì)菌分離與鑒定的流程榆次后溝堡子酒酒曲中細(xì)菌分離與鑒定的流程如下:酒曲菌懸液→平板分離→菌種純化→生理生化試驗(yàn)→鑒定→檢索→結(jié)論。

        1.2.2菌懸液的制備稱取樣品1 g,加入到裝有9 mL無菌去離子水的錐形瓶?jī)?nèi)(內(nèi)有小玻璃珠),用搖床振蕩20 min,菌懸液即制備完成。

        1.2.3細(xì)菌的分離純化

        1)梯度濃度菌懸液的制備。用無菌吸管從菌懸液中吸取1 mL菌液,加入到裝有9 mL無菌去離子水的試管中充分混勻,然后從該試管中吸取1 mL菌液加入到另一支裝有9 mL無菌去離子水的試管中,混合均勻,依此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、

        10-5、10-6不同稀釋梯度的菌懸液。

        2)細(xì)菌的分離。細(xì)菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[5],取不同梯度的菌懸液0.1 mL,分別加入到無菌平板中,用涂布棒涂勻,使樣品溶液在培養(yǎng)基上分布均勻。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約24 h至長(zhǎng)出菌落[5]。

        3)細(xì)菌的純化。用接種環(huán)按無菌操作法分別從平板培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)不同形態(tài)的菌落,在新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離,分別放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。重復(fù)以上操作至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落為止,將純化得到的菌種進(jìn)行編號(hào)并分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,繼續(xù)于37 ℃恒溫培養(yǎng)。

        1.2.4細(xì)菌的鑒定根據(jù)經(jīng)典微生物分類法[6]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類,主要是依據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步分類,并對(duì)菌種的形態(tài)特征(如群體特征和個(gè)體特征)和生理生化特征進(jìn)行鑒定[7]。

        1)細(xì)菌的群體形態(tài)學(xué)觀察[8,9]。細(xì)菌的培養(yǎng)特征是指細(xì)菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性,主要觀察菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質(zhì)地、邊緣情況及隆起情況等,并記錄結(jié)果。

        2)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)的觀察。在高倍鏡及油鏡下分別對(duì)獲得的單一菌株的個(gè)體形態(tài)、大小、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性、鞭毛的有無等進(jìn)行觀察[10],并記錄結(jié)果。

        3)細(xì)菌生理生化反應(yīng)的觀察。主要觀察細(xì)菌的營養(yǎng)源利用情況,代謝特征,能否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣以及生長(zhǎng)發(fā)育條件等,對(duì)純化的菌株進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)[10,11]等檢測(cè)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

        2結(jié)果與分析

        2.1細(xì)菌的分離結(jié)果

        從堡子酒酒曲中分離并純化出2株細(xì)菌,分別命名為XJ1和XJ2,主要用于觀察兩株細(xì)菌菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質(zhì)地、邊緣情況及隆起情況等。

        2.2細(xì)菌的鑒定結(jié)果

        2.2.1細(xì)菌菌落形態(tài)鑒定結(jié)果由表1可知,酒曲中的細(xì)菌分別為白色和乳白色兩種,XJ1半透明、菌落呈放射狀,XJ2表面呈粉末狀、較致密。

        2.2.2細(xì)菌個(gè)體形態(tài)鑒定結(jié)果由表2可知,XJ1為革蘭氏陽性菌,XJ2為革蘭氏陰性菌;兩株細(xì)菌的形狀均為桿狀且都有莢膜;XJ1無芽孢,XJ2有芽孢。

        2.2.3細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各項(xiàng)生理生化測(cè)定,所得結(jié)果見表3和表4。XJ1和XJ2的吲哚試驗(yàn)均為陽性,MR試驗(yàn)均為陽性,淀粉水解試驗(yàn)中XJ1為陰性、XJ2為陽性,糖發(fā)酵試驗(yàn)中XJ1和XJ2均能利用葡萄糖和半乳糖,均不能利用蔗糖。

        3小結(jié)與討論

        該研究通過對(duì)后溝堡子酒酒曲進(jìn)行分析處理、稀釋培養(yǎng)、分離純化后,根據(jù)菌種鑒定文獻(xiàn)[5,12]鑒定得到2株細(xì)菌XJ1和XJ2。

        生理生化反應(yīng)當(dāng)中,兩株細(xì)菌均能利用葡萄糖和半乳糖作為碳源,但均不能利用蔗糖作為碳源,這說明不同的細(xì)菌能通過分解不同的糖類來獲取其生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)。兩株細(xì)菌在分解葡萄糖和半乳糖時(shí)均只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣。兩株細(xì)菌在進(jìn)行吲哚試驗(yàn)時(shí)均能產(chǎn)生色氨酸酶,它可以分解蛋白胨中的色氨酸,從而產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。XJ1對(duì)淀粉無分解能力,而XJ2對(duì)淀粉有分解能力。

        根據(jù)其形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]可初步檢索得出2株菌株的所屬菌屬,XJ1為乳酸桿菌屬,XJ2為芽孢桿菌屬。

        酒中的眾多香味成分來源于細(xì)菌代謝[14,15]。此次試驗(yàn)初步得出了酒曲中細(xì)菌的種類,為優(yōu)化酒質(zhì)量,改善酒質(zhì),提高堡子酒營養(yǎng)價(jià)值,開發(fā)堡子酒系列新品種提供了科學(xué)根據(jù)。堡子酒和山西汾酒同屬清香型白酒,國內(nèi)對(duì)汾酒的研究已非常廣泛,而堡子酒尚屬首例,本研究填補(bǔ)了堡子酒研究的空白,并可以充實(shí)和完善山西清香型白酒的系統(tǒng)研究。

        對(duì)酒曲中存在的細(xì)菌進(jìn)行了研究,涉及其分離純化和初步鑒定,并確定到屬。在以后的研究中將采用分子生物學(xué)方法對(duì)未知菌進(jìn)行進(jìn)一步的菌種鑒定。通過對(duì)微生物的16 S rDNA序列分析等,從基因水平對(duì)酒曲微生物進(jìn)行定性和定量研究,直接、微觀地探討微生物種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及其與環(huán)境間的相互關(guān)系,對(duì)酒曲進(jìn)行更深層次的研究,為酒曲生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供理論支撐。

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