谷廷敏等

[摘要]目的：觀測臨床創(chuàng)面愈合中表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）基因和表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFr）基因的表達(dá)，探討EGF和EGFr基因表達(dá)變化在創(chuàng)面修復(fù)中的作用。方法：應(yīng)用原位雜交方法對臨床患者斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因表達(dá)變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果：臨床創(chuàng)面愈合過程中，EGF、EGFr基因表達(dá)有明顯規(guī)律性的變化，傷后4天，創(chuàng)面內(nèi)EGF基因表達(dá)較弱，EGFr基因表達(dá)很強(qiáng)；傷后10天，創(chuàng)面內(nèi)EGF基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，分布范圍增大，而EGFr基因表達(dá)較傷后4天減弱，分布范圍減?。粋?6天，創(chuàng)面內(nèi)EGF、EGFr基因表達(dá)強(qiáng)度均較傷后10d明顯減弱，EGF表達(dá)強(qiáng)度接近傷后4天的水平，而EGFr基因表達(dá)已基本呈陰性。結(jié)論：EGF、EGFr基因表達(dá)變化與創(chuàng)面修復(fù)的過程有明顯相關(guān)，EGF、EGFr基因表達(dá)變化參與了創(chuàng)面修復(fù)過程，合理調(diào)控其表達(dá)變化有助于創(chuàng)面修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]EGF基因；EGFr基因；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號(hào)]R622R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1985-02

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及局部出血、滲出、炎性浸潤、細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等過程。既往，筆者觀察到：在動(dòng)物供皮區(qū)創(chuàng)面和燒傷患者創(chuàng)面中，EGF、EGFr基因有明顯的表達(dá)變化，提示：創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因有明顯的規(guī)律性表達(dá)變化，且與創(chuàng)面愈合過程明顯相關(guān)[1-3]。為進(jìn)一步探討EGF、EGFr基因表達(dá)變化與創(chuàng)傷愈合關(guān)系的普遍性，筆者又對臨床供皮區(qū)創(chuàng)面愈合過程中的EGF、EGFr基因表達(dá)變化進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1標(biāo)本留?。哼x取燒傷或整形患者的中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面共32例，男19例，女13例，年齡22～49歲?；颊邿o特殊疾患。供皮區(qū)創(chuàng)面位于大腿或下腹部。征得患者同意，分別于術(shù)后4天、10天、16天，在局麻下用眼科角膜環(huán)鉆切取包括創(chuàng)面、創(chuàng)基及少量皮下脂肪在內(nèi)的標(biāo)本，并取正常皮膚作為對照。

1.2 原位組織雜交方法：將留取的標(biāo)本置于4%的多聚甲醛液固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5μm的組織切片，用地高辛標(biāo)記EGF、EGFr cDNA探針后，進(jìn)行組織切片的原位雜交：組織切片脫蠟入水，0.2mol/L鹽酸酸化，蛋白酶K消化，酒精脫水，置預(yù)雜交液（42℃）預(yù)雜交4h，入雜交液雜交（42℃）17h后，用Dig-DNA labelling and detection（ Boegringer Mannheim公司產(chǎn)品 ）試劑盒觀察切片中EGF、EGFr基因活化表達(dá)的mRNA的變化情況，以確定創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因表達(dá)狀況。400倍光鏡下測定其相對含量，以所見視野內(nèi)無陽性細(xì)胞為陰性，連續(xù)記數(shù)5個(gè)視野，求出每個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，當(dāng)視野內(nèi)有10個(gè)以下陽性細(xì)胞時(shí)，表達(dá)強(qiáng)度確定為弱陽性（+）；當(dāng)視野內(nèi)有11～20個(gè)陽性細(xì)胞時(shí)，表達(dá)強(qiáng)度確定為中等陽性（++）；當(dāng)視野內(nèi)有21個(gè)以上陽性細(xì)胞時(shí)，表達(dá)強(qiáng)度確定為強(qiáng)陽性（+++）。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用組間方差分析

2結(jié)果

本組中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合時(shí)間平均為18.5天（17.5～19.5天）。所用地高辛標(biāo)記的EGF、EGFr基因cDNA探針進(jìn)行的原位雜交陽性結(jié)果為藍(lán)紫色細(xì)顆粒，分布于細(xì)胞漿或少量的胞核內(nèi)。正常皮膚內(nèi)無明顯的陽性細(xì)胞。傷后4天，EGFr基因在創(chuàng)面內(nèi)有明顯的表達(dá)，主要分布在創(chuàng)面內(nèi)的成纖維細(xì)胞胞漿和創(chuàng)緣上皮基底細(xì)胞胞漿內(nèi)，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚附屬上皮細(xì)胞中，多較密集分布，表達(dá)強(qiáng)度為（++--+++），視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為18.60±2.6；而EGF基因表達(dá)相對較弱，主要分布在創(chuàng)面淺層，陽性細(xì)胞呈稀疏分布，表達(dá)強(qiáng)度為（+），視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為9.50±1.6。傷后10天， EGF基因在創(chuàng)面內(nèi)表達(dá)較傷后4天增強(qiáng)，除分布在創(chuàng)面淺層的成纖維細(xì)胞胞漿和創(chuàng)緣上皮基底細(xì)胞胞漿內(nèi)以外，尚可見分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚附屬上皮細(xì)胞中，創(chuàng)面的中層和深層也可見有表達(dá)，多較密集分布，表達(dá)強(qiáng)度為（+++），視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為23.40±3.1；而EGFr基因表達(dá)較傷后4天減弱，分布范圍減小，主要分布在創(chuàng)面淺層，表達(dá)強(qiáng)度為（+--++），視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為11.50±1.3。傷后16天，EGF、EGFr基因在創(chuàng)面內(nèi)表達(dá)的強(qiáng)度較傷后10天均減弱。EGF表達(dá)強(qiáng)度接近傷后4天的水平，僅限于在臨近愈合上皮的淺層和創(chuàng)面的淺層，分布在成纖維細(xì)胞胞漿，表達(dá)強(qiáng)度近（+）左右，視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為10.45±1.2；傷后16天，EGFr基因表達(dá)已基本陰性，視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)量為2.3±0.6。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，傷后10天EGF基因表達(dá)較傷后4天和傷后16天明顯增強(qiáng)，P<0.05；傷后4天和16天比較無明顯差別，P>0.05；傷后4天EGFr基因表達(dá)較傷后10天增強(qiáng)，P<0.05；而傷后10天EGFr基因表達(dá)又較傷后16天明顯增強(qiáng)，P<0.05。

3 討論

創(chuàng)面愈合是機(jī)體對外來損傷刺激而引起的一系列信號(hào)反應(yīng)，其最終達(dá)到對損傷的修復(fù)，其中包括組織細(xì)胞的遷移增殖、肉芽組織的形成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、再上皮化等過程。在創(chuàng)傷修復(fù)中，許多種生長因子及其相關(guān)基因發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)和控制了其發(fā)展變化和結(jié)果[4]；在這些生長因子中，EGF和EGFr是很重要的生物分子，各種刺激引起EGF、EGFr基因表達(dá)后，組織中EGF、EGFr增多，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，加快創(chuàng)面愈合[5]。EGF通過與EGFr結(jié)合發(fā)揮作用，而EGFr也是體內(nèi)許多生長因子的共同作用途徑，對介導(dǎo)多種生長因子的作用起很重要的調(diào)節(jié)作用，EGF可以誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞快速定向分化，促進(jìn)損傷皮膚再生[6]。

本研究表明：在人的中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合過程中，EGFr基因在傷后4天、EGF基因在傷后10天均有明顯的表達(dá)，EGFr基因表達(dá)為由強(qiáng)到弱，傷后4天表達(dá)強(qiáng)度大于傷后10天，傷后10天表達(dá)強(qiáng)度大于傷后16天；EGF基因表達(dá)為由弱到強(qiáng)，再由強(qiáng)到弱，EGF基因表達(dá)傷后10天時(shí)較傷后4天和傷后16天明顯增強(qiáng)；傷后4天和16天比較無明顯差別。筆者知道：創(chuàng)面愈合過程中傷后4天，創(chuàng)緣和創(chuàng)基增殖雖不明顯，而此時(shí)EGFr基因表達(dá)可能有助于細(xì)胞EGFr蛋白的合成，細(xì)胞高含量的敏感EGFr又有助于細(xì)胞結(jié)合EGF蛋白，發(fā)揮EGF生物效應(yīng)。從時(shí)相上看，EGFr基因早于EGF基因的高表達(dá)更體現(xiàn)了組織細(xì)胞在為明顯的宏觀修復(fù)做好生理和生化方面的準(zhǔn)備。傷后10天正是細(xì)胞增殖組織修復(fù)的旺盛時(shí)期，這與EGF、EGFr基因的高強(qiáng)度表達(dá)也相一致；本組斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合時(shí)間為18.5天，傷后16天，創(chuàng)面已大體愈合，創(chuàng)面基本上皮化，此時(shí)組織內(nèi)細(xì)胞雖仍有增殖，但EGF、EGFr基因表達(dá)已明顯減弱，創(chuàng)傷修復(fù)調(diào)控已發(fā)生很大變化。這種機(jī)體內(nèi)在的EGF、EGFr基因變化可能是皮膚組織修復(fù)“接觸性抑制”和避免過度增生的機(jī)制之一，可以看出有很強(qiáng)的生理意義。從表達(dá)的細(xì)胞可看出EGF、EGFr基因多表達(dá)在創(chuàng)緣和創(chuàng)基的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚附屬上皮細(xì)胞，這些部位的細(xì)胞EGF、EGFr基因高表達(dá)就可以使局部產(chǎn)生更多的EGF、EGFr蛋白，這樣就有助于組織的修復(fù)。有人報(bào)道，將EGF和水凝膠一起做成制劑，利用水凝膠緩慢釋放特性延長EGF藥效，可以達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用[7]；還有人將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與EGF一起制成微囊，應(yīng)用于人工皮膚中觀察對創(chuàng)面愈合的影響，發(fā)現(xiàn)可以取得更有效的修復(fù)效果[8]。筆者認(rèn)為：在創(chuàng)面愈合過程中，內(nèi)源性EGF、EGFr基因的表達(dá)活化，增加了組織中EGF、EGFr蛋白的含量，在促進(jìn)和介導(dǎo)多種生長因子作用方面都會(huì)有很重要的作用。采取合理的措施，通過外在干預(yù)和內(nèi)部作用使EGF、EGFr基因和蛋白表達(dá)處于合理的狀態(tài)，對加快創(chuàng)面愈合會(huì)有很大的積極意義。

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[收稿日期]2012-07-02[修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟