解芳等

[摘要]目的：探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）及成骨誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（OM-BMSCs）對(duì)同種異體的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的免疫調(diào)節(jié)作用。方法：分離比格犬BMSCs，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（osteogenic medium，OM）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，建立BMSCs、OM-BMSCs與同種異體PBMCs的共培養(yǎng)體系，分三種實(shí)驗(yàn)條件，共9組。A組：5×104受體PBMCs 加入5×104供體PBMCs共培養(yǎng)；B組：A組組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；C組：A組組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板；D組：5×104受體PBMCs加入植物血凝素A（PHA）刺激物；E組、F組：將D組組分按B、C組方式處理；G組：5×104受體PBMCs加入IL-2炎癥因子；H組、I組：G組組分按B、C組方式處理。A、D、G組分別為三個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的對(duì)照組，單獨(dú)接種1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作為空白對(duì)照組Blank1組、Blank2組。以上各組分別培養(yǎng)120h后，應(yīng)用CellTiter96 Aqueous檢測(cè)各組PBMCs的增殖情況。結(jié)果：在各實(shí)驗(yàn)條件下與相應(yīng)對(duì)照組相比較，BMSCs與OM-BMSCs均能抑制雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中PBMCs的增殖，均能抑制經(jīng)PHA刺激后PBMCs的增殖，均能抑制經(jīng)IL-2刺激后PBMCs的增殖（P<0.01）。結(jié)論：BMSCs及成骨分化的BMSCs對(duì)刺激細(xì)胞、PHA、IL-2刺激的同種異體PBMSs的增殖均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，成骨分化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)同種異體免疫反應(yīng)仍具有免疫調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞]成骨分化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；同種異體；免疫調(diào)節(jié)

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1976-05

近年來，隨著組織工程的興起和發(fā)展，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）構(gòu)建組織工程骨已成為骨組織重建修復(fù)的一個(gè)新途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有很強(qiáng)自我更新能力的原始細(xì)胞，具有多向分化潛能，可分化為不同類型的細(xì)胞，如骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等[1-4]，另外研究發(fā)現(xiàn)BMSCs免疫原性低且有免疫調(diào)節(jié)作用。它能抑制由非特異性絲裂原（PHA等）、炎癥細(xì)胞因子（IL-2、Anti-CD3 Ab）等誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖[5-8]。

自體BMSCs要達(dá)到一次治療量，需要在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增，其過程可能要花大約一個(gè)月的時(shí)間。因此，對(duì)于一些急性嚴(yán)重的骨缺損，可能錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)，將無法應(yīng)用于其臨床治療。同種異體BMSCs來源廣泛，易于獲取，彌補(bǔ)了自體細(xì)胞來源缺乏的不足，在臨床運(yùn)用上有著廣闊的前景和重要的意義。同時(shí)，成骨誘導(dǎo)對(duì)于構(gòu)建組織工程骨至關(guān)重要，成骨分化后的BMSCs是否仍能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，在體內(nèi)各種刺激因子的作用下是否能保持免疫調(diào)節(jié)功能，這是同種異體骨組織工程體內(nèi)構(gòu)建成功與否的重要前提。

本實(shí)驗(yàn)旨在探索成骨分化的同種異體BMSCs在三種實(shí)驗(yàn)條件下（雙向MLR、PHA刺激、IL刺激）是否能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步同種異體組織工程骨的體內(nèi)構(gòu)建提供免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料：普通級(jí)成年Beagle犬3只[許可證號(hào)： SCXK （京） 2007-0005]，體重10～13kg，雌雄不限，經(jīng)北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)檢站檢測(cè)，由瑪斯公司提供，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定[9]。各試劑及儀器見表1。

1.2 方法

1.2.1 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化：原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種后48h換液，去除未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。約7天后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，按1.6× 104/cm2密度傳代。第1次傳代后，一部分細(xì)胞加入含10nmol/L地塞米松、10mmol/L β-磷酸甘油鈉、50μmol/L L-2-磷酸抗壞血酸的DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Osteogenic Medium）；另一部分細(xì)胞作為陰性對(duì)照，仍用普通含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以后每3天傳代1次，傳至第2代細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.2犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化鑒定：茜素紅染色：制備經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定2h，加入配制的茜素紅染液（茜素紅0.1g溶于蒸餾水100ml，調(diào)節(jié)pH值至7.2），染色5min，洗去染液后以丙酮洗數(shù)秒、丙酮/二甲苯洗數(shù)秒，樹酯封片后倒置相差顯微鏡下觀察。

堿性磷酸酶染色：制備經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天的細(xì)胞爬片，甲醛固定同上，BM-Purple試劑盒染色，染色后固定、封片、鏡下觀察同上。

1.2.3 第三方BMSCs、OM-BMSCs滅活備用：取第2代BMSCs、OM-BMSCs細(xì)胞懸液0.9ml，加入100μg/ml的絲裂霉素C 0.1ml，使其終濃度為10μg/ml，放置于37℃，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱滅活2h。之后分別用普通培養(yǎng)基、成骨培養(yǎng)基洗滌3次以去除殘余的絲裂霉素C，重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照實(shí)驗(yàn)分組，取1×104/孔接種于96孔板相應(yīng)位置，隔天待BMSCs完全貼壁后將原有培養(yǎng)基吸出，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外分別單獨(dú)接種1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作為空白對(duì)照組（Blank1組、Blank2組）。

1.2.4 犬外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分離抽取2只互為同種異體比格犬外周血5ml，緩慢加入到含有3.5ml Ficoll Plus淋巴細(xì)胞分離液的15ml離心管中，離心2000rpm，20min。吸取中間白色云霧狀的有核細(xì)胞層，即分離得到PBMCs。用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基，含10%FBS、1%青鏈霉素、50μM 2-ME）重懸后離心1000rpm，5min，洗滌2次后細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別作為供體細(xì)胞和受體細(xì)胞。

1.2.5 第三方BMSCs、成骨誘導(dǎo)的BMSCs（OM-BMSCs）對(duì)于雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中PBMCs增殖的影響：96孔培養(yǎng)板共分三組，每組7個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系總量為200μl，不足者以淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充。A組：將供體和受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，作為對(duì)照組；B組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；C組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)測(cè)定PBMCs的OD值。OD值（B組-Blank1）代表B組PBMCs的增殖情況；OD值（C組-Blank2）代表C組PBMCs的增殖情況。

1.2.6第三方BMSCs、OM-BMSCs對(duì)于經(jīng)PHA刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養(yǎng)板共分三組，每組7個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系總量為200μl，不足者以淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充。D組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入植物血凝素A（PHA），終濃度為1μg/ml，作為對(duì)照組；E組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板； F組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)測(cè)定PBMCs的OD值。OD值（E組-Blank1）代表E組PBMCs的增殖情況；OD值（F組-Blank2）代表F組PBMCs的增殖情況。

1.2.7第三方BMSCs、OM-BMSCs對(duì)于經(jīng)IL-2刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養(yǎng)板共分三組，每組7個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系總量為200μl，不足者以淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充。G組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入IL-2、OKT3（anti-CD3 antibody），終濃度為100U/ml，作為對(duì)照組。H組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；I組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)測(cè)定PBMCs的OD值。OD值（H組-Blank1）代表H組PBMCs的增殖情況；OD值（I組-Blank2）代表I組PBMCs的增殖情況。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間均數(shù)比較行一維方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)分化及鑒定：應(yīng)用密度梯度離心法分離得到原代BMSCs，接種培養(yǎng)48h 后逐漸形成大而清晰的細(xì)胞集落形成單位，貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞（圖1），培養(yǎng)7天后，細(xì)胞融合達(dá)80%以上，胰酶消化傳代后細(xì)胞迅速進(jìn)入快速增殖期，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，逐漸由長(zhǎng)梭形漸變?yōu)槎檀中位蛉切危▓D2）。成骨誘導(dǎo)后14天，堿性磷酸酶染色呈陽性，細(xì)胞胞漿呈藍(lán)、綠色