嚴(yán)春 劉彩霞 閆紹榮(等）

[摘要] 目的 構(gòu)建小鼠Wnt—5a逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，觀察Wnt—5a在3T3細(xì)胞的表達情況。 方法 采用同源重組技術(shù)將小鼠Wnt—5a插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PMX—IRES—GFP，構(gòu)建PMX—IRES—Wnt5a重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，RT—PCR檢測Wnt—5a mRNA表達情況，Western—Bloting檢測Wnt—5a蛋白表達情況。 結(jié)果 經(jīng)限制性內(nèi)切酶證實成功構(gòu)建了攜帶Wnt—5a基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PMX—IRES—Wnt5a，RT—PCR檢測結(jié)果顯示W(wǎng)nt—5a在轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞的表達明顯增高。 結(jié)論 成功構(gòu)建Wnt—5a逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并能在3T3細(xì)胞成功表達Wnt—5a。

[關(guān)鍵詞] Wnt—5a；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

[中圖分類號] R782[文獻標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）25—0007—02

Construction of mouse PMX—IRES—Wnt5a retroviral expression vector and expression of Wnt—5a in NIH3T3 cells

YAN Chun1 LIU Caixia2 YAN Shaorong1 LI Qiang1 LIN Sen1 WU Wenbing1 WU Lifeng1 CHEN Jiong3

1. Department of Clinical Laboratory，the Peoples Hospital of Ruian City in Zhejiang Province，Ruian 325200，China；

2. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027，China；3. Department of Burn，the Peoples Hospital of Ruian City in Zhejiang Province，Ruian 325200，China

[Abstract] Objective To construct the retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5a，transfect into 3T3 cells，and observe the expression of Wnt—5a. Methods Gene recombinant technology was employed to clone mouse Wnt—5a gene to the retroviral expression vector of PMX—IRES—GFP， to obtain the recombined plasmid PMX—IRES—Wnt5a，transfect into 3T3 cells by Lipofectamine 2000. The result of transfection was analyzed by RT—PCR and Western—Blotting. Results Identification by enzyme digestion confirmed successful construction of the retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5a . RT—PCR revealed that the expression of Wnt—5a mRNA and protein was obviously increased in 3T3 cells after transfection. Conclusion The retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5ais successfully constructed and stably expressed in 3T3 cells.

[Key words] Wnt—5a； Retroviral expression vector

Wnt信號具有多種生物學(xué)功能，廣泛存在于各種不同物種的生物發(fā)育及疾病發(fā)生過程中。Wnt途徑也參與了外胚層組織器官的生物學(xué)過程，具有調(diào)控皮膚及其附屬器的發(fā)育，誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞向皮膚附件的形態(tài)發(fā)生，調(diào)節(jié)毛囊的周期生長，促進創(chuàng)面修復(fù)等功能。因此，通過病毒轉(zhuǎn)染皮膚干細(xì)胞，以無細(xì)胞真皮替代物為載體誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞高表達Wnt信號從而促進皮膚干細(xì)胞遷移至受損皮膚并定向分化、增殖形成毛囊，有可能成為解決皮膚功能性重建的新途徑。本研究成功構(gòu)建了小鼠PMX—IRES—Wnt5a逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并在3T3細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達，為研究Wnt信號通路在皮膚功能性重建中的功能、作用機制等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PMX—IRES—GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（Clontech，USA）；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶（BioLabs，NEW ENGLAND）；RNeasy Mini試劑盒、OneStep RT—PCR試劑盒（Qiagen，Germany），膠回收試劑Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0（大連寶生物工程有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 （Invitrogen，USA）；感受態(tài)細(xì)菌DH5α（Invitrogen，USA），高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胰蛋白酶（Invitrogen，USA）；所有引物合成及測序由上海生工完成。

1.2 PMX—IRES—Wnt5a逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與鑒定方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank上鼠Wnt—5a的mRNA功能全長序列，采用Primer 5.0設(shè)計一對引物，并導(dǎo)入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，其引物序列如下：Sense： 5'—CCC A↑AGCTT GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3' （HindⅢ）；Antisense：5'— CGC G↑GATCC GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3' （BamHⅠ）。

1.2.2 目的基因獲取RNeasy Mini試劑盒提取小鼠總RNA，采用OneStep RT—PCR試劑盒進行PCR擴增獲得Wnt—5a基因產(chǎn)物，凝膠電泳后采用膠回收試劑Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0進行回收純化，純化產(chǎn)物進行測序鑒定。

1.2.3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將PMX—IRES—GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，與上述PCR純化產(chǎn)物于4 ℃條件下12 h連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α中，細(xì)菌轉(zhuǎn)化及克隆篩選，質(zhì)粒少量提取，酶切鑒定（質(zhì)粒采用BamHⅠ和HindⅢ做雙酶切鑒定），DNA測序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，隨機選取10個視野，熒光細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比為轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后3T3細(xì)胞中Wnt—5a mRNA的表達情況采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。根據(jù)GenBank上小鼠Wnt—5a的mRNA功能全長序列，采用Primer 5.0設(shè)計一對引物，其引物序列如下：Sense5′—GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3′，Antisense 5′—GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3′，擴增產(chǎn)物的片段長度為120 bp。設(shè)計并合成內(nèi)參照β—actin引物，Sense 5′—TGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT—3′ ，Antisense 5′—ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA—3，擴增產(chǎn)物的片段長度為95 bp。參照OneStep RT—PCR試劑盒實驗操作說明進行RT—PCR，以空白組為對照，采用2—△△CT法計算Wnt—5a mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 目的基因Wnt—5a的克隆

提取小鼠組織總RNA經(jīng)RT—PCR獲得目的基因，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示片段長度約1.4 kb ，片段大小與預(yù)期值一致（圖1）。

圖1 Wnt—5a目的基因電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒PMX—IRES—Wnt5a的構(gòu)建與鑒定

將PMX—IRES—GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與上述PCR純化產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì)粒，酶切鑒定（質(zhì)粒采用BamHⅠ和HindⅢ做雙酶切鑒定），DNA測序鑒定。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比較與GenBank上收錄的原始序列一致。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡觀察可見大量綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率為4×107 TU/mL。

2.4 轉(zhuǎn)染后3T3細(xì)胞中Wnt—5a mRNA的表達情況

與空白組比較，Wnt—5a表達明顯增高（圖2）。電泳結(jié)果顯示W(wǎng)nt—5a擴增產(chǎn)物的片段長度為120 bp，內(nèi)參照β—actin擴增產(chǎn)物的片段長度為95 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功（圖3）。

圖2 轉(zhuǎn)染7 d后3T3細(xì)胞中Wnt—5a mRNA的相對表達水平

圖3 RT—PCR檢測轉(zhuǎn)染后3T3細(xì)胞中Wnt—5a mRNA的表達

3 討論

大面積燒傷患者創(chuàng)面愈合后常常會發(fā)生瘢痕攣縮畸形，加上自體皮源的匱乏，給后期整復(fù)帶來了很大的困難。復(fù)合皮（composite skin）的出現(xiàn)為解決這一難題提供了一種新的臨床治療方法[1]。當(dāng)前燒傷醫(yī)學(xué)強調(diào)在挽救生命的基礎(chǔ)上重視患者生存質(zhì)量的改善，復(fù)合皮移植雖然使深度燒傷患者皮膚的部分功能得到改善或恢復(fù)，但由于缺乏必要的皮膚附屬器官如皮脂腺、汗腺、毛囊，導(dǎo)致皮膚干燥、溫度失衡，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量[2]。如何在復(fù)合皮中實現(xiàn)毛囊、汗腺等附件的重建及皮膚附件再生機制的研究是復(fù)合皮移植研究的未來發(fā)展趨勢。

汗腺、皮脂腺大多通過毛囊開口于皮膚表面，毛囊再生是皮膚功能性再生的標(biāo)志；傳統(tǒng)觀點認(rèn)為受損皮膚的毛囊是無法自主再生的，國外學(xué)者在《Nature》上發(fā)表的最新研究報告表明毛囊可以再生[3，4]，研究人員利用成年鼠制造全層皮膚損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傷口中間會長出新毛，老鼠皮膚傷口的毛囊再生過程類似于胚胎毛囊發(fā)育過程的變化；靜止的胚胎分子信號途徑被“喚醒”，將皮膚干細(xì)胞送至皮膚受損處；這些稍后分化為可再生毛囊的干細(xì)胞，并非通常與毛囊再生相關(guān)的毛囊干細(xì)胞，而是來自表皮細(xì)胞[3]。

研究人員發(fā)現(xiàn)通過構(gòu)建Wnt逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，增強表達Wnt基因的分子信號，老鼠可以長出更多毛發(fā)[4]。越來越多的證據(jù)表明，Wnt基因是毛囊再生過程中的關(guān)鍵基因[5]；且Wnt—5a作為單基因就能夠誘導(dǎo)、促進皮膚干細(xì)胞遷移至受損皮膚形成毛囊[6]。

大量資料證明Wnt信號具有多種生物學(xué)功能，廣泛存在于各種不同物種的生物發(fā)育及疾病發(fā)生過程中。Wnt途徑也參與了外胚層組織器官的生物學(xué)過程，具有調(diào)控皮膚及其附屬器的發(fā)育，誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞向皮膚附件的形態(tài)發(fā)生，調(diào)節(jié)毛囊的周期生長，促進創(chuàng)面修復(fù)等功能。因此，通過病毒轉(zhuǎn)染皮膚干細(xì)胞，以無細(xì)胞真皮替代物為載體，誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞高表達Wnt信號從而促進皮膚干細(xì)胞遷移至受損皮膚并定向分化、增殖形成毛囊，有可能成為解決皮膚功能性重建的新的途徑。

但是，異種真皮基質(zhì)和自體真皮基質(zhì)畢竟存在很大差異， Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在異種真皮基質(zhì)中是如何誘導(dǎo)、促進皮膚干細(xì)胞遷移至受損皮膚形成毛囊，是否存在其他關(guān)鍵的信號分子，毛囊再生不同階段信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有無異同，針對毛囊再生過程中復(fù)雜的分子機制去如何進行多基因靶點協(xié)同調(diào)控以提高毛囊再生效率等問題有待解決，因此對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究不僅使復(fù)合皮移植毛囊再生機制得到進一步的闡明，也將給燒傷患者的皮膚功能性重建提供了新的有效治療途徑。 本研究構(gòu)建了Wnt—5a逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并成功轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，為進一步研究Wnt信號通路刺激誘導(dǎo)皮膚分化增殖及毛囊再生的機制奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]陳璧，湯朝武，龔熙，等. 復(fù)合皮移植的實驗研究與臨床應(yīng)用[J]. 中華燒傷雜志，2004 ，20（6）：347—350.

[2]Martin P. Wound healing——aiming for perfect skin regeneration[J]. Science，1997，276（5309）：75—81.

[3]Chuong CM. Regenerative biology：new hair from healing wounds[J]. Nature，2007，447（7142）：265—266.

[4]Ito M，Yang Z，Andl T，et al. Wnt—dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding[J]. Nature，2007，447（7142）：316—320.

[5]Reya T，Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature，2005，434（7035）：843—850.

[6]Fathke C，Wilson L，Shah K，et al. Wnt signaling induces epithelial differentiation during cutaneous wound healing[J]. BMC Cell Biol，2006，7：4.

（收稿日期：2012—04—01）