李雪萍等

摘要：為研究不同生境下珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）的遺傳多樣性，以珙桐葉片為材料優(yōu)化建立珙桐的ＡＦＬＰ反應(yīng)體系。對酶切與連接中ＤＮＡ的濃度、預(yù)擴(kuò)增的引物、選擇擴(kuò)增中Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰｓ的濃度進(jìn)行梯度比較分析。結(jié)果顯示，酶切與連接過程中ＤＮＡ的濃度變化對結(jié)果影響不大，預(yù)擴(kuò)增的引物是否帶有選擇堿基對結(jié)果影響明顯，選擇擴(kuò)增中ｄＮＴＰｓ濃度的變化對最終譜帶影響不大，而Ｍｇ２＋濃度變化會對最終譜帶產(chǎn)生影響，以１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ為宜。采用優(yōu)化后的體系，從１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４組ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增引物組合中篩選出能夠得到清晰擴(kuò)增譜帶的７組引物組合，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）；ＡＦＬＰ；體系優(yōu)化；引物篩選

中圖分類號：S792.99；Q503文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0831-04

珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）為珙桐科珙桐屬落葉大喬木，是我國特有的單型屬孑遺植物，是國家一級保護(hù)植物［１］。珙桐天然分布在貴州、湖南、湖北、陜西、四川、云南及甘肅７省，分布范圍較窄，資源量較少，僅限于一些邊遠(yuǎn)山區(qū)的人跡罕至之地［２］。珙桐素有“中國活化石”之稱，在植物系統(tǒng)發(fā)育和地史變遷上有很高的研究價值，對珙桐進(jìn)行遺傳多樣性研究，可以為有效保護(hù)和合理利用該珍稀植物提供必要的科學(xué)依據(jù)。目前對珙桐的研究多集中在群落生物學(xué)、人工繁殖與引種栽培方面［３－８］。

ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是荷蘭科學(xué)家Ｚａｂｅａｕ等［９］和Ｖｏｓ等［10］發(fā)展起來的一種檢測ＤＮＡ多態(tài)性的方法，是在ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，具有很多突出的優(yōu)點：所需ＤＮＡ量少，不需要預(yù)知ＤＮＡ序列信息，靈敏度高；多態(tài)性豐富，分辨率高，重復(fù)性好，假陽性低，可靠性高；共顯性。自問世以來，該技術(shù)在物種的品種鑒定、種質(zhì)資源和遺傳多樣性等［１1－１3］方面的研究中被廣泛應(yīng)用。

本研究對影響ＡＦＬＰ擴(kuò)增體系的相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化篩選，初步建立了適于珙桐的ＡＦＬＰ反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展該物種遺傳多樣性的ＡＦＬＰ分析奠定了基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

試驗材料為神農(nóng)架木魚鎮(zhèn)神農(nóng)架國家級自然保護(hù)區(qū)科研所旁與神農(nóng)祭壇下功德林內(nèi)移栽的珙桐，取其幼葉于冰壺中，帶回實驗室后置于－７０ ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取方法參考鄒喻蘋等［１4］介紹的ＣＴＡＢ法，稍做改良后提取珙桐的總ＤＮＡ［１5］。在紫外可見分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ－２８００）上，于波長２６０、２８０ ｎｍ處測定其吸光度，計算ＤＮＡ濃度；采用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像系統(tǒng)（ＢＩＯ－ＲＡＤ）觀察拍照。

１．２．２ＡＦＬＰ試驗方法

１）酶切與連接。參照Ｖｏｓ等［10］的方法，酶切與連接一步完成。２０ μＬ酶切與連接體系中包含３.00 μＬ ＤＮＡ，１２．２５μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０0 μＬ １０×Ｔ４ Ｂｕｆｆｅｒ，０．３0 μＬ ＭｓｅⅠ（１０ Ｕ／μＬ），０．１５ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ（２０ Ｕ／μＬ），１．０0 μＬ ＥｃｏＲ Ⅰ接頭（５ ｐｍｏｌ／μＬ），１．０0 μＬ Ｍｓｅ Ⅰ接頭（５０ ｐｍｏｌ／μＬ），０．３0 μＬ Ｔ４－ＤＮＡ連接酶（４ Ｕ／μＬ）。３７ ℃酶切與連接４ ｈ以上。其中珙桐總ＤＮＡ作梯度稀釋（２００、１００、５０、３０、１５ ｎｇ）。接頭與引物序列見表１。

２）預(yù)擴(kuò)增。將酶切與連接產(chǎn)物用ｄｄＨ２Ｏ稀釋８倍作預(yù)擴(kuò)增模板，在試驗中對不含任何堿基和含一個選擇堿基的預(yù)擴(kuò)增引物（ＭｓｅⅠ－Ｃ、ＥｃｏＲⅠ－Ａ）進(jìn)行篩選（表１）。２０ μＬ的預(yù)擴(kuò)增體系中有３.0 μＬ模板，１０．９ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６ μＬ ｄＮＴＰs（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．２ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．６ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．６ μＬ ＥｃｏＲⅠ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１μＬ Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）。擴(kuò)增程序為９４ ℃預(yù)變性２ ｍｉｎ； ９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０個循環(huán)；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。預(yù)擴(kuò)增完成后，?。?μＬ預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在０．８％瓊脂糖凝膠中檢測預(yù)擴(kuò)增的效果，剩余產(chǎn)物于－２０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

３）引物篩選與選擇性擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋１５倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板ＤＮＡ，在預(yù)擴(kuò)增引物的３′末端加上３個堿基作為選擇性擴(kuò)增引物（表１），從這１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４個ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增引物組合中篩選適合珙桐的選擇擴(kuò)增引物。２０ μＬ的選擇擴(kuò)增體系中有５．００ μＬ模板，８．２５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．００ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６０ μＬ ｄＮＴＰｓ（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．４０ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．８０ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．８０ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１５ μＬ Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）。擴(kuò)增程序為９４ ℃預(yù)變性３ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，６５ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，退火溫度每個循環(huán)遞減０．７℃，共有１３個循環(huán)；９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０個循環(huán)；最后７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。

為了確定珙桐最佳的ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增條件，選用引物ＥｃｏＲⅠ－ＡＡＣ／ＭｓｅⅠ－ＣＴＴ，以３個珙桐個體的總ＤＮＡ混合液作為模板，對ＰＣＲ的影響因素Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs作濃度梯度測試，進(jìn)行單因素試驗研究，各因素與水平見表２。

４）ＰＣＲ產(chǎn)物檢測。選擇擴(kuò)增產(chǎn)物加入８ μＬ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（９８０ ｇ／Ｌ甲酰胺，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２．５ ｇ／Ｌ 二甲苯氰，２．５ ｇ／Ｌ溴酚藍(lán)），混合，９５ ℃變性５ ｍｉｎ后立刻轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻，避光，待用。制備６％的變性聚丙烯酰胺凝膠，預(yù)電泳３０ ｍｉｎ，恒定功率９５ Ｗ，上樣擴(kuò)增產(chǎn)物６ μＬ后繼續(xù)電泳，約２ ｈ時停止電泳。采用銀染方法顯帶，經(jīng)過脫色、固定、銀染、顯影、定影等過程，膠板在室溫下自然干燥。

２結(jié)果與分析

２．１ＤＮＡ檢測結(jié)果與分析

采用改良后的ＣＴＡＢ方法提取珙桐的總ＤＮＡ，紫外可見分光光度計檢測２６０、２８０ ｎｍ處的吸光度比值A(chǔ)２６０ ｎｍ／A２８０ ｎｍ為１．８左右。ＤＮＡ瓊脂糖電泳圖譜條帶整齊、清晰，基本無降解，完整性好。由于ＡＦＬＰ分析對供試ＤＮＡ的要求高，所以提取高質(zhì)量、高純度的ＤＮＡ是ＡＦＬＰ分析成功的關(guān)鍵之一。許多研究者認(rèn)為，多糖、多酚、色素等會嚴(yán)重影響ＤＮＡ聚合酶的活性，干擾引物與模板的結(jié)合，從而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。因此，在ＣＴＡＢ提取液中添加了較高濃度的ＰＶＰ４０，這樣能夠有效地去除多糖類、多酚類等物質(zhì)的影響，提高ＤＮＡ的純度。ＰＶＰ４０有很強的結(jié)合多酚的能力，結(jié)合后可防止酚類氧化成醌類，避免溶液變褐而具有抗氧化作用，也可防止ＤＮＡ酶降解ＤＮＡ［１4］，同時還能有效去除多糖。

２．２ＡＦＬＰ試驗結(jié)果與分析

２．２．１酶切與連接Ｖｏｓ等［10］指出，多切點的酶產(chǎn)生小的ＤＮＡ片段，這些片段能很好地被擴(kuò)增，適于在變性序列膠上分離，少切點的酶可減少被擴(kuò)增的片段，而兩種酶組合后ＥｃｏＲ Ⅰ／Ｍｓｅ Ⅰ產(chǎn)生的片段才是主要擴(kuò)增的片段，故采用雙酶切可以極其靈活地控制被擴(kuò)增片段的大小和數(shù)目。因而，雙酶切反應(yīng)進(jìn)行得是否完全，將直接影響試驗結(jié)果。ＡＦＬＰ的前提是酶切要完全，而預(yù)擴(kuò)增是檢測酶切與連接效果的手段。理想的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后邊緣清晰、呈紡錘形、分子量大小適當(dāng)，產(chǎn)物片斷大小為１００～１ ０００ ｂｐ適宜。

在實際操作中，酶切與連接分步操作與酶切與連接一步進(jìn)行未見差別，最終選擇酶切與連接一步進(jìn)行的操作。酶切與連接中ＤＮＡ梯度變化結(jié)果顯示ＡＦＬＰ反應(yīng)對模板ＤＮＡ濃度不敏感，ＤＮＡ濃度的高低變化基本沒有影響，均能得到清晰的ＡＦＬＰ圖譜，?。?μＬ ＤＮＡ稀釋液約３０ ｎｇ為目的ＤＮＡ進(jìn)行酶切與連接，接頭采用通用ＭｓｅⅠ接頭、ＥｃｏＲⅠ接頭（表１）。酶切與連接后的瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖１，結(jié)果顯示彌散帶為１００～１ ０００ ｂｐ，可以繼續(xù)后面的試驗步驟。

２．２．２預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增中發(fā)現(xiàn)引物不帶任何選擇堿基與帶一個選擇堿基的預(yù)擴(kuò)增終產(chǎn)物帶型差異很大，帶一個選擇堿基的引物對應(yīng)的預(yù)擴(kuò)增終產(chǎn)物擴(kuò)增條帶數(shù)量明顯減少，因此最終確定采用不帶任何選擇性堿基的引物作為預(yù)擴(kuò)增引物。

２．２．３引物篩選與選擇擴(kuò)增ＰＣＲ反應(yīng)中，一般認(rèn)為，Ｍｇ２＋濃度不僅影響Ｔａｑ酶的活性，還能與反應(yīng)液中的ｄＮＴＰs、ＤＮＡ模板及引物結(jié)合，影響引物與模板的結(jié)合效率、模板與產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成；ｄＮＴＰs是反應(yīng)的原料，ｄＮＴＰs濃度過高，會導(dǎo)致ＰＣＲ錯配，從而使擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性，濃度過低又會影響合成效率［１6］。

試驗對選擇擴(kuò)增時的Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs的濃度梯度優(yōu)化顯示，ｄＮＴＰs的濃度變化時，產(chǎn)物的帶型及強弱差別不大，說明對于珙桐的ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增來說，ｄＮＴＰs的濃度變化對產(chǎn)物的影響不大，如圖２所示；而Ｍｇ２＋的濃度變化有一定影響，Ｍｇ２＋的濃度較低時（１．００、１．５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）條帶較弱，條帶數(shù)量也較少，隨Ｍｇ２＋濃度的升高，條帶強度增強，即產(chǎn)物產(chǎn)量增加，當(dāng)Ｍｇ２＋濃度達(dá)到１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ后，帶型趨于穩(wěn)定，如圖２。最終選擇１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇ２＋及０．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰs進(jìn)行ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增。

從１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４個ＡＦＬＰ選擇擴(kuò)增引物組合中篩選適合珙桐的引物組合，其中７個引物組合能夠得到清晰的擴(kuò)增條帶，其組合見表３。

２．２．４產(chǎn)物檢測ＡＦＬＰ技術(shù)經(jīng)歷著由同位素標(biāo)記技術(shù)、生物素標(biāo)記技術(shù)、銀染技術(shù)向熒光標(biāo)記技術(shù)的轉(zhuǎn)化。由于同位素的不安全因素，現(xiàn)在部分實驗室采用生物素標(biāo)記（如地高辛）代替同位素標(biāo)記，其靈敏性略低于或相當(dāng)于同位素，其優(yōu)點是沒有放射性，對人體不會造成傷害，但采用生物素標(biāo)記流程較長，步驟比同位素標(biāo)記繁瑣，而且成本高。銀染技術(shù)是將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用銀染方法代替放射性標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性的檢測。雖然銀染技術(shù)比同位素標(biāo)記操作安全且成本較低，對人體的傷害較?。ㄣy染過程所用的甲醛也有毒害），但流程比較長，穩(wěn)定性較差，染色和顯色反應(yīng)受環(huán)境溫度、染色和顯影的時間及溫度、染色液和顯影液的組成等多種因素的影響，但隨著操作的逐步熟練，銀染能夠在溫度相對恒定的條件下操作，有很好的效果。本試驗就是采用了銀染技術(shù)。

此外，研究中發(fā)現(xiàn)ＡＦＬＰ標(biāo)記的指紋式樣會因不同廠家的Ｔａｑ酶甚至不同批次的酶而異，與明軍等［１７］建立梅花基因組ＡＦＬＰ體系時的觀點一致。因此，在使用某一種酶后，應(yīng)立即訂購?fù)粡S家足夠量的同批次酶，以保證試驗的正常進(jìn)行和圖譜的穩(wěn)定性、可比性，盡量減少誤差。

３結(jié)論

盡管ＡＦＬＰ試驗操作較為復(fù)雜，但由于其高效性，越來越多的研究者采用ＡＦＬＰ進(jìn)行相關(guān)的遺傳研究。研究通過對酶切與連接中ＤＮＡ的濃度、預(yù)擴(kuò)增的引物、選擇擴(kuò)增中Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs濃度的梯度比較分析，建立起適合珙桐的ＡＦＬＰ體系，為今后開展相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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