山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 王興華

蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 孫 盈

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中（Mandels，1976）。從自然界分離篩選新的纖維素酶高產(chǎn)菌株，可為生產(chǎn)高活性纖維素酶提供新菌種或酶基因（閆峰等，2009）。本試驗(yàn)從山西大學(xué)校園內(nèi)采集各種樹木和灌木叢下的土樣，菌種經(jīng)初篩和復(fù)篩及紫外誘變，以旨得到纖維素酶高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 原料及儀器

1.1.1 主要試劑 DNS試劑，羧甲基纖維素鈉，新華定性濾紙，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，檸檬酸緩沖液。

1.1.2 主要儀器 721可見分光光度計(jì) （上海佑科儀器儀表有限公司），電子天平JA1203N（上海精密科學(xué)儀器有限公司），手提式高壓蒸氣消毒器YXQSG46-280型（遼寧省丹東市日用五金廠），臺(tái)式恒溫箱振蕩器THZ-82A型（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），干燥箱101-2型（中華人民共和國(guó)上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠），水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司），離心沉淀器80-2型（上海手術(shù)器械廠），顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉 （CMCNa）8 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨 2.5 g，酵母膏 0.5 g，水 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 7.0～7.2。

1.2.2 保存培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基） 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2.3 剛果紅-羧甲基纖維素瓊脂培養(yǎng)基 （葉姜瑜，1997）。

1.3 菌種的篩選

1.3.1 土樣采集 在山西大學(xué)校園內(nèi)采集各種樹木和灌木叢下，距土地表面5 cm處的混有枯枝及落葉的土樣，共10份。

1.3.2 菌種的初篩 將不同稀釋倍數(shù)的樣品溶液涂布于1.2.3培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑選HC（透明圈直徑與菌落直徑之比）大的菌落，保藏于PDA培養(yǎng)基斜面，以備復(fù)篩。

1.3.3 菌株的復(fù)篩 從PDA斜面培養(yǎng)基上挑取初篩菌種，按一定的接種比接入發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30℃恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)其纖維素酶活，重復(fù)3次取平均值。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 粗酶液的制備 將2 mL的無菌水分別倒入12株初篩得到的菌株斜面，之后無菌操作轉(zhuǎn)入到裝有40mL的CMCNa液體培養(yǎng)基中，于30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4 d。液體發(fā)酵液在5000 r/min離心15 min，取上清液為粗酶液。

1.4.2 酶活測(cè)定方法

1.4.2.1 酶活的定義 CMC酶活單位定義為：在pH為7.0、溫度為50℃條件下，每30 min水解CMCNa釋放1 mg葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，以U表示。濾紙酶活單位定義為：在pH為7.0、溫度為50℃條件下，每1 h水解濾紙條釋放1 mg葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，以U表示。

1.4.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，編號(hào)后加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.4、0.8、1.2、l.6、2.0 mL， 并依次加蒸餾水2.0、l.6、l.2、0.8、0.4、0 mL， 配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。在520 nm波長(zhǎng)下，以1號(hào)試管作為空白對(duì)照，調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定其他各管溶液的吸光度值（A）并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)。

1.4.2.3 酶活力的測(cè)定 采用DNS法測(cè)定菌株的CMC酶活和濾紙酶活（錢存柔和黃儀秀，1999）。

1.5 紫外線誘變?cè)囼?yàn)

1.5.1 孢子懸浮液的制備 挑取斜面培養(yǎng)基的一環(huán)菌，接入5 mL液體培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h。然后在無菌條件下從中吸取125 μL菌液接入另一管5 mL液體培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后從中吸取2 mL菌液至100 mL液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出菌液后5000 r/min離心15 min，棄去上清液，用5 mL的無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀，倒入裝有45 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，搖床20 min，振蕩搖勻后將菌體稀釋成108個(gè)/mL左右的孢子懸浮液，10 mL待用。

1.5.2 紫外線（UV）誘變 將上述配好的待用菌液10 mL于9 cm的平皿內(nèi)，放入轉(zhuǎn)子置于磁力攪拌器上，紫外燈（254 nm，30 W）位于培養(yǎng)皿上方 30 cm 處，設(shè)定不同的輻射時(shí)間（1、2、3、4 min）進(jìn)行誘變。誘變處理后的菌懸液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，并涂平板，之后避光培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果 見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 初篩結(jié)果 本試驗(yàn)共篩選出30株能在剛果紅-羧甲基纖維素瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的菌株，其中HC值＞1的有12株，編號(hào)從F1到F12，并對(duì)各個(gè)菌株的透明圈直徑和菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見表1。由表1可知，F(xiàn)1的透明圈直徑最大，菌株F4的菌落直徑最大，菌株F8的HC值最大。

表1 透明圈和菌落的直徑及其比值

2.3 復(fù)篩結(jié)果 為了進(jìn)一步研究纖維素分解菌的酶特性，篩選出高酶活的菌株，對(duì)初篩的12株菌進(jìn)行液體發(fā)酵4 d，并測(cè)定其CMC酶活，結(jié)果見表 2。由表 2 可知，F(xiàn)1、F2、F3、F5、F6、F8 具有較高的酶活，通過初篩結(jié)果可知，這6株菌在初篩試驗(yàn)中透明圈直徑和菌落直徑也有較大的比值。

表2 不同菌株酶活測(cè)定結(jié)果

2.4 菌株的紫外誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果

2.4.1 紫外誘變致死率 菌懸液在紫外燈輻射不同時(shí)間后，按不同稀釋梯度涂布于剛果紅-羧甲基纖維素培養(yǎng)基，30℃避光培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌株死亡率。紫外輻射3 min，致死率達(dá)到90%；紫外輻射4 min，致死率達(dá)到99%以上。紫外輻射時(shí)間與致死率的關(guān)系見圖2。

圖2 紫外誘變致死率

2.4.2 菌株F6紫外誘變結(jié)果 在其他條件不變的情況下設(shè)定不同的時(shí)間梯度（1、2、3、4 min），其中1～3 min的誘變效果不理想，透明圈大小與酶活均不高，4 min的誘變效果較為突出。由表3可見，菌株4-2-2的濾紙酶活和CMC酶活最高，分別達(dá)到1827.372 U/mL和3171.598 U/mL；菌株4-2-3的 HC值（D/d）最大，但濾紙酶活和CMC酶活均不是最高；菌株4-2-7的CMC酶活與濾紙酶活比值最大，說明所產(chǎn)纖維素酶以內(nèi)切酶為主要成分。

2.4.3 菌株4-2-2的鏡檢特征 通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株4-2-2的孢子絲較直，有隔膜，有二叉分枝。菌絲成熟后斷裂成單個(gè)或成鏈、長(zhǎng)筒形、末端鈍圓的節(jié)孢子。

2.4.4 菌落透明圈的比較 原始菌株F6的菌落直徑及透明圈直徑均小于突變株，其中菌株4-2-2的透明圈為最大，HC值也為最大值。結(jié)合2.4.2及2.4.4的結(jié)果，說明經(jīng)4 min的紫外誘變處理后，得到一株能高產(chǎn)濾紙酶和CMC酶的菌株4-2-2。

2.4.5 突變株與原始菌株產(chǎn)酶活性能的比較 由圖3可知，菌株4-2-2產(chǎn)濾紙酶和CMC酶的酶活均比出發(fā)菌株高很多，并且均在第4天酶活達(dá)到最高值。

2.4.6 變異株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 為了測(cè)定突變株產(chǎn)酶的穩(wěn)定程度，將突變菌株4-2-2在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定酶活，結(jié)果見表4。由表4可知，各重復(fù)值之間差異均不顯著，因此，該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖3 突變株與原始菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活性比較

表4 傳代次數(shù)對(duì)酶活的影響U/mL

3 結(jié)論

人工誘變選育高酶活的纖維素酶產(chǎn)生菌及優(yōu)化其產(chǎn)酶條件是降低纖維素酶生成本的重要方法（Thomas，1992）。 張海生等（2004）研究報(bào)道，以原始菌株里氏木霉M277為出發(fā)菌株，采取紫外誘變，經(jīng)初篩、復(fù)篩獲得M277-7高產(chǎn)菌株。本研究從土樣中分離篩選出12株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得了產(chǎn)纖維素酶活較高且穩(wěn)定的菌株F6。以該菌株為出發(fā)菌株用紫外燈（254 nm，30 W）對(duì)其進(jìn)行物理誘變，并設(shè)置不同的誘變時(shí)間（1、2、3、4 min），獲得纖維素酶高產(chǎn)菌株4-2-2。通過DNS法測(cè)定菌株4-2-2的酶活，其CMC酶活達(dá)3171.598 U/mL，濾紙酶活達(dá)1827.372 U/mL，分別比出發(fā)菌株提高3.58倍和8.67倍。本試驗(yàn)對(duì)菌種進(jìn)行誘變時(shí)僅采用紫外線照射，對(duì)于利用復(fù)合誘變技術(shù)是否有更為理想的效果還有待于進(jìn)一步研究。

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