山東寶來利來生物工程股份有限公司 徐海燕 張志焱 谷巍

目前，在國內(nèi)飼料中鐵元素主要以無機(jī)制劑形態(tài)添加，由于這些制劑在儲存或消化過程中會被酸化，從而使Fe2+變成難吸收的Fe3+（王利偉等，2002）。無機(jī)鐵與有機(jī)鐵相比具有不易吸收，對黏膜有刺激性，胃腸道副作用較大和不具有生物活性的特點（Gaudreau等，2001）。研究證實，酵母是一種較為理想的微量元素載體（李志東等，2006）。對于富鐵酵母而言，其主要是利用酵母細(xì)胞吸收多、轉(zhuǎn)化快的特性，使其作為微量元素的載體，在細(xì)胞內(nèi)將無機(jī)鐵轉(zhuǎn)化成有機(jī)形式，提高鐵的利用率，還可為動物機(jī)體提供大量的菌體蛋白、多肽、小肽、消化酶、氨基酸、豐富的B族維生素以及其他生物活性物質(zhì)（許禎瑩等，2010）。本試驗擬研究酵母菌富集微量元素鐵的影響因素，并確定富鐵酵母的最佳培養(yǎng)條件，為富鐵酵母的發(fā)酵生產(chǎn)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 5株產(chǎn)朊假絲酵母 （Candida utilis），編號為 CRJ1、CRJ2、CRJ3、CRJ4、CRJ5；2 株啤酒酵母，編號為PJ1、PJ2。均由山東寶來利來生物產(chǎn)業(yè)集團(tuán)生物研究院菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：10°Bx的麥芽汁培養(yǎng)基，取1份麥芽粉加5份水，65℃水浴中保溫4 h，使其糖化，直至糖化完全 （檢查方法是取0.5 mL的糖化液，加2～3滴碘液，如無藍(lán)色出現(xiàn)，即表示糖化完全）；發(fā)酵培養(yǎng)基：采用YPD培養(yǎng)基，葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L，pH 6.0。

1.3 主要試劑 硫酸亞鐵、硫酸鐵銨、硝酸鐵、鄰二氮菲、鹽酸羥胺等均為分析純。

1.4 主要儀器 高壓滅菌鍋、超凈工作臺、酸度計、超聲波破碎儀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、UV-2000紫外可見分光光度計、電子天平、高速離心機(jī)、電熱板等。

1.5 方法

1.5.1 培養(yǎng)方法

1.5.1.1 液體種子將活化好的斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基 （50 mL/250 mL三角瓶）中，28℃培養(yǎng)16 h左右。

1.5.1.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種到含有Fe2+的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)。其他培養(yǎng)條件由具體的試驗確定。

1.5.2 分析方法

1.5.2.1 菌體生物量的測定 取一定體積發(fā)酵液5000 r/min離心20 min，棄上清液，蒸餾水洗滌3次，最后收集菌體，60～70℃干燥后稱重即得。

1.5.2.2 酵母細(xì)胞鐵含量的測定 將富鐵酵母細(xì)胞發(fā)培養(yǎng)液5000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水沖洗3次后，收獲菌體，干燥至恒重后，采用鄰二氮菲比色法測定鐵的含量（成都科學(xué)技術(shù)大學(xué)與浙江大學(xué)化學(xué)教研室，1993）。

1.5.2.3 富鐵酵母中有機(jī)鐵和無機(jī)鐵的測定 收集培養(yǎng)后的酵母菌液，5000 r/min離心20 min后棄上清液，然后用蒸餾水沖洗沉淀，再離心，重復(fù)3次，最后收集菌體4℃冷藏備用。準(zhǔn)確稱取一定量冷藏備用的菌體配制為25 mL懸浮液（加入相當(dāng)于6倍菌體重的含10%甘油，20 mmol/L Mg-Cl2·6H2O，pH 為 8.6 的 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液），破碎細(xì)胞后得到上清液（包括無機(jī)鐵和鐵蛋白）。在上清液中加入60%固體硫酸銨粉末，輕微振蕩5 min后靜置2 h，5000 r/min離心20 min以沉降含鐵蛋白。取上清液測定無機(jī)鐵含量。沉降的細(xì)胞殘片和含鐵蛋白65℃烘干后，混勻，取樣測定有機(jī)鐵含量。

1.5.3 試驗設(shè)計

1.5.3.1 菌種篩選 將7株試驗菌株接入種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。以5%的接種量接種到含硫酸亞鐵量為 600 μg/mL的YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集菌體測定生物量和鐵含量。

1.5.3.2 不同鐵鹽對鐵富集的影響 選用幾種常用的鐵鹽作為鐵源，鐵離子濃度均為400 μg/mL。28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后，測定生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.3 鐵離子濃度對富鐵酵母的影響 將酵母依次接種到鐵含量為 0、200、400、600、800、1200、1600、2000 μg/mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.4 起始pH對富鐵酵母的影響 將發(fā)酵培養(yǎng) 基 的 初 始 pH 分 別 調(diào) 為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每 500 mL三角瓶裝液量 50 mL，接種量2%，28℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.5 接種量對富鐵酵母的影響 在500 mL三角瓶裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將液體種子按2%、4%、6%、8%、10%的量接入到上述培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.6 裝液量對富鐵酵母的影響 在500 mL三角瓶中分別裝入不同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件相同，28℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響 在其他條件相同的情況下，分別在發(fā)酵0、12、18、24 h向培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵至濃度為800 μg/mL來Fe2+，培養(yǎng)36 h結(jié)束，測定生物量、酵母細(xì)胞中鐵的含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.8 實驗室發(fā)酵罐培養(yǎng) 富鐵酵母菌株生長曲線的測定：在裝有5.0 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.0 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，根據(jù)實驗室三角瓶篩選出的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行恒定pH培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選 由表1可知，7株酵母菌對鐵的耐受能力均較強(qiáng)，產(chǎn)朊假絲酵母的生物量較高，均在1.20 g/100mL以上，啤酒酵母的稍低，但也均在1.00 g/100 mL以上。鐵的轉(zhuǎn)化率均在50%以上，酵母細(xì)胞中的鐵含量均比較高，在24000 μg/g以上，其中CRJ3的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)70.2%，酵母細(xì)胞中的鐵含量達(dá)到31200 μg/g，且總鐵含量也最高，達(dá)到421.2 mg/L。綜合考慮，以CRJ3作為試驗用菌株。

2.2 不同鐵鹽對鐵富集的影響 由表2可知，在相同的培養(yǎng)條件下，菌株CRJ3細(xì)胞與各種鐵化合物均能產(chǎn)生結(jié)合。試驗所用的5種鐵鹽對其生物量的影響較小，但對鐵的富集有較大的影響，其中硫酸亞鐵作為鐵源時，酵母細(xì)胞中的鐵及總鐵含量均最高，達(dá)到21124 μg/g和293.6 mg/L，轉(zhuǎn)化率為73.4%，因此，在后續(xù)的試驗中采用硫酸亞鐵作為鐵源。

表1 7株酵母菌富鐵能力比較

表2 不同鐵鹽對鐵富集的影響

2.3 鐵鹽濃度對富鐵酵母的影響 不同硫酸亞鐵濃度下菌株CRJ3的細(xì)胞生物量及鐵富集情況見表3。由表3可知，鐵鹽濃度在0～800 μg/mL范圍內(nèi)變化時，菌株CRJ3的生長趨于平緩，且總鐵含量在800 μg/mL時達(dá)到最高，為508.1 mg/L；當(dāng)起始濃度高于800 μg/mL時，隨著培養(yǎng)基中鐵濃度的升高菌株的生長受到明顯的抑制，但總鐵含量差異不顯著。綜合考慮，確定培養(yǎng)基中起始鐵濃度為 800 μg/mL。

表3 培養(yǎng)基中Fe2+添加量對富鐵酵母的影響

2.4 起始pH對富鐵酵母的影響 由表4可知，pH對酵母的生長影響較大，即弱酸性條件有利于酵母菌的生長，而中性偏堿的環(huán)境不利于酵母菌的生長；同時對鐵的富集也有較大的影響，pH可明顯影響酵母的生長和代謝，進(jìn)而影響生物量的累積及鐵的富集。在pH為6.5時，生物量達(dá)到最大，為1.36 g/100 mL，但酵母細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率在pH為5.0時達(dá)到最高，分別為39877 μg/g、510.4 mg/L 和 63.8%。 綜合考慮，富鐵酵母的最佳發(fā)酵起始pH確定為5.0。

表4 起始pH值對富鐵酵母的影響

2.5 接種量對富鐵酵母的影響 由表5可知，接種量對酵母鐵的生物量及鐵含量、轉(zhuǎn)化率均有較大的影響，接種量過大，可抑制生物量的累積及鐵的富集；接種量為6%時，生物量達(dá)到最大，為1.39 g/100 mL，接種量為2%時，酵母細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率均最高，分別為34364 μg/g、453.2 mg/L和56.7%。綜合考慮，確定接種量為2%。

表5 接種量對富鐵酵母的影響

2.6 裝液量對富鐵酵母的影響 本試驗利用不同的裝液量模擬溶解氧條件的影響，結(jié)果見表6。由表6可知，裝液量對菌株CRJ3的生物量及鐵的富集有較大的影響。裝液量在75 mL/500 mL三角瓶時，總鐵含量及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最大，分別為410.4 mg/L和51.3%。

2.7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為了確定最佳鐵鹽的加入時間，從而誘導(dǎo)細(xì)胞獲得較高的總鐵含量，試驗設(shè)計在不同發(fā)酵時間點加入硫酸亞鐵800 μg/mL。由表7可知，隨著加鐵時間的延遲，富鐵酵母的生物量呈遞增趨勢，但酵母細(xì)胞中的鐵、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率隨加鐵時間的延遲大幅降低。因此，在發(fā)酵開始即加入硫酸亞鐵，富鐵效果較好，可使細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到34988 μg/g、454.8 mg/L 和 56.9%。

表6 裝液量對富鐵酵母的影響

表7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響

2.8 實驗室發(fā)酵罐培養(yǎng) 按2%的接種量接種，向初始培養(yǎng)基中加入800 μg/mL硫酸亞鐵，在（28～30）℃，初始轉(zhuǎn)速為 180 r/min，罐壓 0.05 MPa下進(jìn)行恒定pH培養(yǎng)（pH=5.0）。主要是根據(jù)培養(yǎng)基pH值的變化流加NaOH溶液，當(dāng)pH低于4.0時，加入堿液使pH升高至5.0。發(fā)酵過程中每2 h時取樣一次，測定發(fā)酵液的生物量以及總鐵含量。以酵母菌的生物量和總鐵含量為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制富鐵酵母菌株CRJ3的生長曲線。由圖1可知，在優(yōu)化發(fā)酵條件下，該菌株在0～6 h處于延滯期，6 h以后進(jìn)入對數(shù)生長期，發(fā)酵24 h生物量達(dá)到最大，24～34 h生物量保持在一個相對穩(wěn)定的數(shù)值。隨著發(fā)酵時間的延長，總鐵含量呈上升趨勢，至24 h達(dá)到最高，之后總鐵含量有下降趨勢。從規(guī)模生產(chǎn)上考慮，發(fā)酵時間可以控制在24 h左右。

在上述優(yōu)化發(fā)酵條件下，對細(xì)胞所富集的鐵進(jìn)行了有機(jī)化程度分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞所富集的鐵中約有98%為有機(jī)鐵。

圖1 菌株CRJ3的生長曲線及鐵富集曲線

3 結(jié)論

3.1 添加硫酸亞鐵對酵母菌的生長有一定的抑制作用，本試驗篩選出一株富鐵能力較高的產(chǎn)朊假絲酵母菌株CRJ3，作為試驗菌株。

3.2 本試驗綜合考慮產(chǎn)朊假絲酵母的生長周期，不同pH下生長的情況，以及耐受鐵的能力等，優(yōu)化得到富鐵酵母的最佳培養(yǎng)條件為：在500 mL三角瓶中裝入75 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基起始pH為5.0，所用的鐵源為硫酸亞鐵，濃度為800 μg／mL，并且在發(fā)酵開始即加入硫酸亞鐵，按2%的接種量，培養(yǎng)時間為24 h，在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵，生物量能達(dá)1.30 g/100 mL，總鐵含量能450 mg/L以上，細(xì)胞中鐵的含量能達(dá)到35 mg/g以上。

3.3 按上述條件，采用實驗室發(fā)酵罐進(jìn)行恒定pH發(fā)酵，所得酵母菌體生物量能達(dá)到1.45g/100mL以上，總鐵含量能夠達(dá)500 mg/L左右，并且細(xì)胞所富集的鐵中約98%為有機(jī)鐵，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

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