武漢工業(yè)學(xué)院動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院

動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室 竇茂鑫 趙迪 丁斌鷹 侯永清 吳濤＊

微生態(tài)飼用添加劑具有良好的生物學(xué)活性，能調(diào)節(jié)動物胃腸道微生物菌群的平衡，促進動物消化吸收、生長發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能，增強動物免疫力，以及具有改善飼養(yǎng)環(huán)境和減少環(huán)境污染的獨特作用（Gomze等，2007；王旭明等，2002）。芽孢乳酸菌因其同時具有乳酸菌和芽孢桿菌的優(yōu)點而成為為理想的益生菌之一 （相菲和徐厚春，2009）。本試驗對飼用芽孢乳酸菌的生物學(xué)特性進行研究，以期為微生態(tài)飼料添加劑的研發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 試驗益生菌：芽孢乳酸菌，由武漢泛華生物技術(shù)有限公司提供；試驗致病菌：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸出物3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，葡萄糖 15 g，瓊脂 15 g，調(diào)整pH 7.2，定容至1000 mL。普通液體培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.1.3 主要試劑 PBS緩沖液，用于菌液的稀釋。

1.1.4 主要器材 電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司），酸度計 （成都方舟科技開發(fā)公司），UV-1200 spectrophoto meter（美譜達儀器公司），立式超低溫保溫箱（海爾公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢乳酸菌的復(fù)蘇 將-20℃保存的菌株按1%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h，待渾濁后進行后續(xù)試驗。

1.2.2 生長曲線測定 將復(fù)蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)，以普通液體培養(yǎng)基作校正，測定不同時間段培養(yǎng)液的OD600值，前24 h每1 h一測，后36 h每2 h一測。

1.2.3 產(chǎn)酸能力測定 將復(fù)蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165r/min條件下培養(yǎng)，測定不同時間段培養(yǎng)液的pH（郭志杰等，2010）。

1.2.4 高溫耐受性試驗 將復(fù)蘇后菌液按1%的接種量接種于PBS緩沖液中，分別置于60、70、80、90℃的水浴鍋中處理10 min，分別于處理前和處理后進行平板涂布，計算存活率 （范俊娟，2009）。

1.2.5 耐酸性試驗 用鹽酸調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH 分別為 2.0、2.5、3.0、4.0，121 ℃高壓滅菌后備用。將復(fù)蘇菌液按1%的接種量接種于上述pH梯度稀釋液中，37℃作用3 h，渦旋混勻，涂布平板進行活菌計數(shù)，以0 h計數(shù)為對照，計算存活率（劉文華等，2008）。

1.2.6 耐膽鹽試驗 用PBS緩沖液配制濃度分別為0.2%、0.5%、0.8%、1.0%的豬膽鹽溶液，高壓滅菌后備用。按1%的接種量將復(fù)蘇菌液接種于上述不同濃度的豬膽鹽溶液中，37℃作用3 h后，涂布平板進行活菌計數(shù)，以處理前細菌數(shù)為對照，計算存活率（趙瑞香等，2004）。

1.2.7 抑菌性試驗 將致病菌分別培養(yǎng)12～24h，按20倍稀釋，取100 μL致病菌液均勻涂布到事先準備好的無菌瓊脂平板上。采用牛津杯法，每個試驗設(shè)3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)12～24 h，測定抑菌圈直徑，以無菌普通液體培養(yǎng)基作對照 （郭志杰等，2010）。

2 結(jié)果

2.1 芽孢乳酸菌的生長曲線測定結(jié)果 由圖1可知，芽孢乳酸菌未經(jīng)過遲緩期，直接進入對數(shù)期生長，0～6 h生長速度最快，6～18 h生長速率減緩，18～26 h生長速率有所提高，26～34 h生物量變化不明顯，達到穩(wěn)定期，34 h生物量開始降低，進入衰亡期。

2.2 芽孢乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定結(jié)果 由圖2可知，0～10 h芽孢乳酸菌產(chǎn)酸能力非常強，培養(yǎng)液的pH迅速降低，10～12 h培養(yǎng)液pH有短暫的回升，然后又繼續(xù)降低，32 h pH為3.60，此時pH降到最低。之后pH逐漸升高，最后pH在3.80左右趨于穩(wěn)定。

圖1 芽孢乳酸菌生長曲線測定結(jié)果

圖2 芽孢乳酸菌產(chǎn)酸能力測定結(jié)果

2.3 芽孢乳酸菌的高溫耐受性試驗結(jié)果 由圖3可知，對芽孢乳酸菌進行高溫處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在60℃處理10 min后存活率達94.37%，90℃處理10 min后存活率高達70%以上，說明芽孢乳酸菌對高溫有較好的耐受性。

圖3 芽孢乳酸菌高溫耐受性試驗結(jié)果

2.4 芽孢乳酸菌的耐酸性試驗結(jié)果 益生菌要到達腸道發(fā)揮作用，必須經(jīng)過胃酸的作用，因此其必須具有良好的耐酸能力，才能到達腸道發(fā)揮功能。由圖4可知，對該芽孢乳酸菌進行酸處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在pH 2.0環(huán)境中存活率高達54.69%，說明芽孢乳酸菌具有較好的耐酸特性。

2.5 芽孢乳酸菌的耐膽鹽試驗 結(jié)果 益生菌到達十二指腸時要受到膽鹽的抑制作用，因此必須有較高的膽鹽耐受性，才能發(fā)揮益生特性。由圖5可知，對該芽孢乳酸菌進行膽鹽處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在0.2%豬膽鹽溶液中存活率在90%以上，在1.0%的豬膽鹽溶液中存活率超過20%，說明芽孢乳酸菌具有較強的耐膽鹽特性。

圖4 芽孢乳酸菌耐酸性試驗結(jié)果

圖5 芽孢乳酸菌耐膽鹽試驗結(jié)果

2.6 芽孢乳酸菌的抑菌性試驗結(jié)果 由表1可知，芽孢乳酸菌對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，其中對沙門氏菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為19.76 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌性最弱，但抑菌圈直徑也較大?？傮w看來，芽孢乳酸菌對腸道常見致病菌具有較強的抑制作用。

表1 芽孢乳酸菌抑菌試驗結(jié)果

3 結(jié)論

益生菌通過添加到飼料進入胃腸道,在胃腸道中定殖,并能通過大量繁殖的有益菌發(fā)揮其益生作用。研究表明,理想的益生菌應(yīng)具有生長速度快、對胃腸道環(huán)境(胃酸、膽鹽等)耐受能力強,具有一定的抑菌能力等特點 （Geimonde和Salminen，2006）。 Hyronymus等（2000）研究報道,芽孢乳酸桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌在pH 2.0中生長受到強烈的抑制。Guo等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，中低質(zhì)量分數(shù)膽鹽(≤0.3%)對芽孢桿菌的存活影響很??；而高質(zhì)量分數(shù)的膽鹽（>0.3%）對不同來源菌株的耐受能力就表現(xiàn)出明顯的差異（王煥等，2008）。芽孢桿菌的抑菌作用，不同菌株各有不同。王德培等（2010）對分離到的1株枯草芽孢桿菌的抑菌譜進行了研究，結(jié)果表明，該枯草芽孢桿菌具有廣譜抗真菌活性。陳家祥等（2010）研究報道，加地衣芽孢桿菌有益于肉雞的腸道發(fā)育，能夠抑制盲腸內(nèi)有害菌的生長。

本試驗表明，此株芽孢乳酸菌具有較好的生長性能和產(chǎn)酸能力，在24 h之后會逐步進入穩(wěn)定期，最終pH值會達到3.80左右，這有利于在消化道內(nèi)定植后快速生長及維持消化道的酸性環(huán)境。此外，芽孢乳酸菌具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，可耐受90℃高溫，有利于微生態(tài)添加劑的生產(chǎn)；能耐受pH 2.0的酸性環(huán)境，存活率達到50%以上，使芽孢乳酸菌能順利通過胃內(nèi)酸性環(huán)境到達腸道發(fā)揮生物學(xué)功能；對豬膽鹽溶液也有較高的耐受性，在發(fā)揮功能的同時免受豬膽汁酸的抑制作用。從整體水平可以看出，此株芽孢乳酸菌具有較好的生物學(xué)功能，可以作為微生態(tài)飼料添加劑生產(chǎn)使用。

[1]陳家祥，張仁義，王全溪，等.地衣芽孢桿菌對麻羽肉雞腸道組織結(jié)構(gòu)及盲腸微生物區(qū)系的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，22（3）：757 ～ 761.

[2]范俊娟.豬源芽孢桿菌的分離及其生物學(xué)特性的檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，9：93 ～ 94.

[3]郭志杰，李杰，李鑫，等.豬源乳酸菌的分離篩選鑒定及產(chǎn)酸性能的研究[J].飼料工業(yè)，2010，31（20）：45 ～ 48.

[4]劉文華，任慧英，鄒玲.一株優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定與特性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，3（2）：152 ～ 154.

[5]王德培，房健慧，孟慧，等.芽孢桿菌BL 1的鑒定及其抑菌性研究[J].中國抗生素雜志，2010，35（3）：181 ～ 184.

[6]王煥，郭曉軍，張偉，等.1株雞腸源益生芽孢桿菌的分離鑒定及其耐受特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（33）：14426 ～ 14430.

[7]王旭明，陳宗澤，袁毅.益生菌作用機理的研究進展[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，27（1）：50 ～ 53.

[8]相菲，徐春厚.芽孢乳酸菌類微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2009，28（1）：42 ～ 44.

[9]趙瑞香，孫俊良，李元瑞，等.嗜酸乳桿菌抗酸抗膽汁鹽能力的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，32（2）：57 ～ 60.

[10]Geimonde M，Salminen S.New methods for selecting and evaluating probiotics[J].Digestive and Liver Dis-ease，2006，38（2）：242 ～ 247.

[11]Gomze R，Geovanny D，Luis B J，et a1.Probiotics as control agents in aquaculture[J].Journal of Ocean University of China，2007，6（1）：76 ～ 78.

[12]Guo X H，Li D F，Lu W Q，et a1.Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs[J].Antoni van Leeuwenhoek，2006，90：139 ～ 146.

[13]Hyronimus B，Marrec C L，Sassi A H，et a1.Acid andbile tolerance of sporeforminglacticacidbacteria[J].FoodMicrobiol，2000，61（2 ～ 3）：193 ～ 197.