李振威,謝麗麗,曹陽,王璐萍,孔令妍,薛恩興,彭磊

(1.浙江溫州醫(yī)學(xué)院臨床系,浙江 溫州 325000;2.浙江溫州醫(yī)學(xué)院附屬二院骨科,浙江 溫州 325000;3.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷中心 ,海南 海口 570102)

隨著當今社會骨創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染率的逐年升高,造成人們骨缺損的現(xiàn)象越來越常見。骨缺損如果范圍較小,骨端可以經(jīng)自身修復(fù)而愈合,但如果骨缺損范圍較大,則不可能自身修復(fù)。自體骨移植被稱為骨移植的金標準,但供區(qū)易發(fā)生疼痛和感染等并發(fā)癥(8%～10%);異體骨移植可出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致骨移植失敗;二者骨來源均有限,移植骨的形狀很難與缺損區(qū)的解剖形狀相符,會影響日后的功能。目前臨床上常用的醫(yī)用硫酸鈣可注射型植骨材料 MIIG X3(minimally invasive injectable graft X3,美國WRIGHT公司)已經(jīng)通過眾多成功的動物實驗和臨床應(yīng)用證實生物相容性、骨傳導(dǎo)性良好[1],是一種安全有效的骨移植替代物,但其吸收速度仍稍快于自身骨替代速度[2],且機械強度仍顯不足,還不適用于大段或承重骨的缺損修復(fù)[3],另外,MIIG X3目前價格較貴,不利于臨床推廣應(yīng)用。因此 ,有必要開發(fā)新的生物骨替代材料。

我們發(fā)現(xiàn)溫州近海牡蠣殼具有資源豐富,結(jié)構(gòu)致密,強度與皮質(zhì)骨相當,Currey等[4]測定牡蠣殼的強度數(shù)據(jù)與文獻中牛的皮質(zhì)骨相當,Mount證實牡蠣殼的形成是由粒細胞不斷分泌的無機鹽堆積而形成的礦物質(zhì)鹽[5],其近納米顆粒的形成與骨沉積有相似的特點,顆粒中 CaCO3成分占到95.994%。最早關(guān)于牡蠣作為生物材料的報道是在1965年,研究表明將其植入小鼠體內(nèi)沒有任何不良反應(yīng)[6]。將牡蠣殼作為新的骨替代材料的原料成為科學(xué)上的可能,將活性天然牡蠣殼和醫(yī)用硫酸鈣可注射型植骨材料復(fù)合制成新型仿生材料,通過將其植入兔橈骨缺損處,對其生物相容性、修復(fù)效果等方面作出評價。

1 資料與方法

1.1 牡蠣殼復(fù)合型骨材料制備步驟 取溫州樂清灣無污染海域近江牡蠣,除去其內(nèi)容物后留外殼。流水下沖刷清洗 3次,自然條件下風干。將風干后的牡蠣殼置于 40%乙酸溶液中浸泡 2h,取出后于流水下沖刷 3次,然后置于流水下沖洗24 h。蒸餾水清洗 3次,于自然條件下風干。機械方法將牡蠣殼碾壓成顆粒狀,分別用 40目和 100目過濾篩過濾,得到約0.15 mm大小的牡蠣殼粉末。采用溶液共混法制備:把消磨后的牡蠣殼碳酸鈣粉劑放入乙醇和氯仿中48h進行脫脂,再浸泡在雙氧水中進行脫蛋白處理,完成好以上的脫抗原處理后將牡蠣殼碳酸鈣粉劑與 MIIG塑形劑按 1∶5混合,固化后期在預(yù)制品表面嵌入成孔材料,并采用熔解成孔材料的方法在預(yù)制品表面形成直徑達 200～400μm的孔隙,并用排液法測定孔隙率為 40%～50%。根據(jù)實驗動物的骨缺損,制作直徑0.5 cm、長度1.0 cm略帶圓餅狀的人工橈骨替代材料。預(yù)制品常規(guī)高溫高壓消毒后備用。把制作好的骨材料進行掃描電鏡觀察,證實誘導(dǎo)新生骨生長的骨材料的基礎(chǔ)性能:骨板交通及近納米顆粒的組成 (見圖1)。

圖1 牡蠣殼復(fù)合型骨材料的制備過程

1.2 牡蠣殼復(fù)合型骨材料體內(nèi)生物相容性試驗

1.2.1 實驗動物及動物模型 將制備完成的骨材料在生物力學(xué)測試機上進行抗壓力、抗剪力和抗扭力等檢測。選擇36只日本健康成年純種大耳白兔作為實驗動物,體質(zhì)量為 2.5～3.3 kg,將實驗動物隨機分成 A、B、C三組 (每組 12只),使用 0.1 g/mL水合氯醛 4 mL/kg進行耳緣靜脈注射麻醉 ,手術(shù)制備出雙側(cè)橈骨骨缺損模型,橈骨骨缺損大小為1.0cm;A組植入取自髂骨的自體骨,為對照組 1,B組植入MIIG人工骨,為對照組 2,C組植入相同大小牡蠣殼人工骨,為實驗組,術(shù)后予以抗感染治療,分別在第2、4、8、12周末時隨機處死動物,每組每批處死 3只(A、B組左側(cè)橈骨為實驗對象,C組右側(cè)橈骨為實驗對象)。

1.2.2 體內(nèi)生物相容性檢測 觀察收集動物術(shù)后飲食、活動、手術(shù)切口愈合情況及植入骨材料周圍組織生長結(jié)合情況等資料。通過X線攝片觀察兔橈骨中段骨材料植入?yún)^(qū)和骨組織結(jié)合情況,材料周圍骨質(zhì)密度及鈣化情況。分別對三組進行組織學(xué)檢測,通過 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察實驗組與對照組 1、2植入?yún)^(qū)新骨形成、骨愈合、生物相容性等情況。

1.2.3 生物力學(xué)檢測 術(shù)后12周,常溫常壓下,取三組各3只兔,處死后取出雙側(cè)橈骨,一起用 IN STRON生物力學(xué)測試系統(tǒng)進行三點抗彎強度測試,跨距40mm,加載速度5mm/min,應(yīng)力下降 50%～60%停止加載 ,比較三組橈骨的抗彎曲強度。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察骨材料交通 牡蠣殼體骨材料是由直徑在 100～300nm的近納米顆粒成團簇狀構(gòu)成,其團簇結(jié)構(gòu)成肉眼無規(guī)則形式。其表面上不規(guī)則地排列著直徑在200～400 μm的孔洞,這些孔洞是由不規(guī)則的片狀層構(gòu)成。骨材料板間有相互溝通的管道系統(tǒng)相聯(lián)系,最寬的管道達 600 nm,平均在 300 nm之間,這和人體骨的骨板、哈佛氏管與浮克曼管的數(shù)量、密度、形狀、孔徑、走向規(guī)律相類似。骨材料板狀體是不規(guī)則排列的,主要以橫、縱兩個方向排列為主。從結(jié)構(gòu)力學(xué)的角度上來說,這種結(jié)構(gòu)具有很大的穩(wěn)定性,既可以抗壓又可以抗拉,強化了整體的結(jié)構(gòu)(見圖2)。

2.2 牡蠣殼復(fù)合型骨材料體內(nèi)生物相容性試驗結(jié)果

2.2.1 大體標本及X線攝片結(jié)果(A組自體骨組、B組MIIG組、C組牡蠣殼復(fù)合型骨材料組) 術(shù)后動物飲食良好,活動正常。術(shù)后1～3 d步態(tài)不穩(wěn),以后逐漸恢復(fù)正常。傷口愈合良好,無一例感染或積液,不用拆線,線結(jié)10 d左右自行脫落,無化膿、感染,無意外死亡。

植入后 2周,術(shù)區(qū)傷口愈合,僅縫線處有輕微紅腫。A、B、C組在橈骨植入床中有輕微的松動、但無塌陷,表面被骨膜完整包裹,包裹 C組骨材料的骨膜及軟組織無壞死和積液,表面的孔隙中充滿未完全機化的血凝塊及肉芽組織,A、B組則較少。 X線攝片,骨材料與自體骨組織均為高密度影,B、C組植入?yún)^(qū)內(nèi)骨材料的密度低于周邊正常骨組織。材料與橈骨缺損之間邊界清晰,移植區(qū)投射分界影像明顯,未見明顯的骨修復(fù)跡象。

圖2 骨材料孔洞、骨板交通、近納米顆粒結(jié)構(gòu)

植入后 4周,B、C組骨材料在植入床內(nèi)無移位及松動,C組術(shù)區(qū)表面軟組織膜包裹完整,結(jié)締組織較2周時密度明顯增加,骨材料外側(cè)可見粉紅色的肉芽軟組織釘突長入骨材料表面的小孔內(nèi),釘突及軟組織易從骨材料表面分離,B組長入骨組織內(nèi)的肉芽組織呈淡粉紅色模糊狀。X線攝片,C組骨材料與骨組織相鄰處有大量骨痂形成,缺損骨斷面因改建而變的圓鈍,并有新生毛細血管及肉芽組織長入,呈不透明狀,包裹骨材料的骨膜及軟組織無壞死和積液,B組少量骨痂,A組缺損明顯(見圖3)。

圖3 各組 4周 X線片顯示,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組移植區(qū)投射分界影像 (‘→′處)

植入后8周,B、C骨材料仍被較厚的軟組織包裹完全,無松動及移位現(xiàn)象,A組骨缺損有少量骨痂生成,無愈合。長入骨材料表面的結(jié)締組織釘突強度及韌性增加,可以從骨材料表面完整的撕脫,其中 C組的血管成分明顯減少,C組橈骨表面形態(tài)及質(zhì)地結(jié)構(gòu)與 A組十分接近。

植入后 12周,B、C組骨材料與相鄰組織結(jié)合緊密,包裹骨材料的組織質(zhì)地較韌、硬度增加,兩者間界線消失,無法完整分開。剖面可見兔橈骨植入?yún)^(qū)域內(nèi)的硬組織厚度增加,人工橈骨周邊形成一層質(zhì)地較軟組織硬的致密層。C組橈骨表面形態(tài)及質(zhì)地結(jié)構(gòu)與無損組織無明顯的差別,已恢復(fù)到正常的組織形態(tài)。X線片觀察,C組骨材料-骨界面之間的透射分界影像消失,而 A、B組投射分界影像還是明顯存在,植入?yún)^(qū)內(nèi) B、C骨材料的密度高于周邊正常骨組織(見圖4)。

圖4 各組 12周 X線片顯示,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組移植區(qū)投射分界影像(‘→′處)

2.2.2 組織學(xué)檢測 蘇木精-伊紅染色光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果:B、C組植骨區(qū)的新生骨面積隨著時間的推移逐漸增加,植骨區(qū)的材料剩余面積隨著時間的推移逐漸減少,且降解速度相對較快(見表1)。植入4周時鏡下觀察C組可見周邊明顯有成骨細胞分泌的新生骨基質(zhì)形成 (見圖5),而 B組則形成模糊新生軟骨基質(zhì)(見圖6)。植入8周時鏡下觀察C組植骨區(qū)有較多的成骨和血管長入材料中,成骨區(qū)內(nèi)可見到錐狀骨陷凹樣結(jié)構(gòu)和骨細胞,管狀結(jié)構(gòu)明顯增多。骨材料周圍大多被大量梭形細胞占據(jù),并有血管長入,新生的骨單位形狀不規(guī)則,周圍的骨質(zhì)尚未完全鈣化,接近皮質(zhì)骨的骨單位較成熟,骨膜下的則更幼稚(見圖7)。B組與 C組相似,但不如 C組成骨活躍。術(shù)后12周 C組骨材料基本降解,植入?yún)^(qū)內(nèi)基本被新生組織填滿,可見大量成骨細胞、脂肪細胞 (見圖8)。

圖5 培養(yǎng) 4周 C組可見明顯骨基質(zhì)形成(蘇木精-伊紅染色,× 50)

圖6 培養(yǎng) 4周 B組可見模糊骨基質(zhì)形成(蘇木精-伊紅染色,×50)

分別在第 2、4、8、12周測量 B、C組新生骨面積和剩余骨面積,計算剩余骨面積和新生骨面積,使用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件,通過多組數(shù)據(jù)方差分析,C組選擇顯著性T=0.05,前者 P=0.042,后者 P=0.001,都有顯著性差異,得出隨著時間的推移,新生骨正在逐步代替骨材料的結(jié)論,與 B組相似具體數(shù)據(jù)見表1。橫向?qū)Ρ葍山M的新生骨面積在2、4、8周時沒有顯著性差異 t＜0.05,在 12周時有顯著性差異 t＞ 0.05,橫向?qū)Ρ葍山M的骨材料剩余顆粒面積 2周時沒有顯著性差異 t＞ 0.05,在 4、8、 12周時有顯著性差異 t＜ 0.05。

圖7 培養(yǎng)8周 C組骨材料周圍見大量新骨形成,材料開始降解(蘇木精-伊紅染色,×50)

圖8 術(shù)后 12周 C組 HE切片,僅見極少量材料殘余(HE染色,× 50)

表1 牡蠣殼骨材料和MIIG骨材料植入?yún)^(qū)新生骨面積百分數(shù)和骨材料剩余顆粒面積百分數(shù)的數(shù)值

2.2.3 生物力學(xué)檢測 牡蠣殼復(fù)合型材料的抗彎曲強度為(46.43± 1.57)M Pa,MIIG組為 (41.20± 2.75)M Pa,自體骨為(47.07±2.40)MPa,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組與 MIIG組 (P＜0.05),MIIG組與自體骨組(P＜0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組與自體骨組(P＞0.05),無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

牡蠣屬于軟體動物門的雙殼綱,全世界的牡蠣有 18屬100多種,我國大概有20種,全世界年產(chǎn)量在80萬噸以上。牡蠣殼資源廣泛,來源豐富,取材不破壞生態(tài)環(huán)境。牡蠣殼含有豐富的微量元素和大量氨基酸[7]。1997年,美國 FDA[8]已經(jīng)批準將牡蠣作為原始材料加工成為牡蠣碳酸鈣補鈣劑。2002年牡蠣鈣獲得國家衛(wèi)生部批號。說明其具有較好的皮質(zhì)骨替代潛能。

實驗通過大體掃描電鏡觀察,牡蠣殼復(fù)合型骨材料橫斷面可以觀測到5～20層致密的骨板樣結(jié)構(gòu),呈同心圓柱排列,板厚度在 200～300nm之間,板間由相互溝通的管道系統(tǒng)相聯(lián)系,最寬的管道達 600 nm,平均在 300 nm左右,這和人體骨的骨板、哈佛氏管與浮克曼管的數(shù)量、密度、形狀、孔徑、走向規(guī)律相類似。用排液法測得的骨材料孔隙率高達 40%～50%左右。當孔隙超過30%以后,孔隙之間可達到互相連通,新骨組織可以從材料表面長入內(nèi)部,形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。骨材料抗壓強度為45～49M P。孔隙率控制在30%～50%,既能達到孔之間相通,又能滿足臨床初期對材料強度的要求,有效地發(fā)揮材料的支架作用[9-14]。這種多孔結(jié)構(gòu)形成的材料三維通道增大了材料與受植區(qū)組織器官的接觸界面,有利于加速界面結(jié)合的反應(yīng)過程,為新骨組織長入材料中提供通道和容納場所,并為攜帶骨誘導(dǎo)物質(zhì)(骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓)提供空間。該材料可根據(jù)需要通過預(yù)制或注塑的方式成形,具有良好的可操作性。植入后即可為缺損區(qū)的軟組織提供足夠的硬組織保護。

大體標本表明,兔橈骨修復(fù)早期為肉芽組織長入材料表面的孔隙內(nèi),而后形成釘突樣結(jié)構(gòu),4周時牡蠣殼復(fù)合型骨材料外側(cè)可見粉紅色的肉芽軟組織釘突長入骨材料表面的小孔內(nèi),醫(yī)用硫酸鈣組有淡粉紅色較模糊肉芽組織長入骨組織內(nèi)。隨著植入時間的推移與材料結(jié)合更加緊密,最終材料與新生骨直接結(jié)合。X線攝片,本研究中修復(fù)材料的密度略低于正常兔橈骨,2周時X線攝片觀察到移植區(qū)內(nèi)密度影低于周邊;8周時牡蠣殼復(fù)合型骨材料與骨組織相鄰處有大量骨痂形成,缺損骨斷面因改建而變得圓鈍,醫(yī)用硫酸鈣組有少量骨痂,自體骨組缺損明顯。12周時牡蠣殼復(fù)合型骨材料組骨材料-骨界面之間的透射分界影像消失,而 A、B組投射分界影像還是明顯存在,高密度影像明顯高于周圍骨床,這表明牡蠣殼復(fù)合型骨材料可以更好地阻止結(jié)締組織的長入,起到三維支架的作用,在兔橈骨缺損區(qū)域內(nèi)引導(dǎo)形成新生骨,新生骨與材料影像疊加形成密度增高影像。

組織學(xué)檢測表明:牡蠣殼復(fù)合型骨材料的空隙之間相互聯(lián)通能為成骨細胞提供良好的攝取營養(yǎng)、生長和黏附空間。4周時有明顯骨基質(zhì)生成,而醫(yī)用硫酸鈣則只有模糊骨基質(zhì)生成,表明牡蠣殼骨誘導(dǎo)性相對較好,8周時牡蠣殼復(fù)合型骨材料組新骨形成和骨材料降解都較明顯,并可見大量血管,內(nèi)含豐富的紅細胞,醫(yī)用硫酸鈣組材料降解更加明顯,自體骨組未見成骨。術(shù)后12周時,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組基本降解,植入?yún)^(qū)內(nèi)基本被新生組織填滿,可見大量成骨細胞、脂肪細胞,而醫(yī)用硫酸鈣組則完全降解,新生骨面積也相對牡蠣殼組小。這表明植入牡蠣殼復(fù)合型骨材料比醫(yī)用硫酸鈣組降解相對較慢,誘導(dǎo)骨生成相對較快,可以更持久的為大段骨缺損提供支架作用。生物力學(xué)測試顯示術(shù)后12周實驗組與自體骨比較抗彎曲強度測試無明顯差別而優(yōu)于醫(yī)用硫酸鈣組,顯示了較好的材料成骨能力。

本實驗組下一步將在牡蠣殼復(fù)合型骨材料中植入骨形態(tài)發(fā)生蛋白和成骨細胞,在體外實驗探究牡蠣殼復(fù)合型骨材料是否對人體組織細胞生長、代謝、增殖產(chǎn)生影響,從無毒、無熱原、無刺激作用、不引起溶血反應(yīng)、無致癌性和致畸作用等方面證明牡蠣殼復(fù)合型骨材料的良好生物相容性。

本實驗證明牡蠣殼復(fù)合型骨材料相對現(xiàn)今常用醫(yī)用硫酸鈣骨材料有著更好的生物學(xué)特性、骨誘導(dǎo)性、成骨能力,并能更持久的提供支架作用修復(fù)骨缺損。所以初步認為天然牡蠣殼納米體復(fù)合型骨材料具備骨缺損修復(fù)材料所需的良好生物學(xué)特性。

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