李 強(qiáng)，莫業(yè)和，劉運(yùn)生

垂體腺瘤是臨床常見的顱內(nèi)腫瘤，絕大多數(shù)呈組織學(xué)良性表現(xiàn)，但仍有一部分呈侵襲性生長，導(dǎo)致手術(shù)完全切除困難，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，目前仍是臨床治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α) 是普遍存在于人和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。本研究通過檢測HIF-1αmRNA和蛋白在垂體腺瘤中的表達(dá)情況，探討HIF-1αmRNA和蛋白的表達(dá)與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2006年4—9月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科垂體腺瘤手術(shù)標(biāo)本42例，其中男20例，女22例;年齡16～60歲，平均40．6歲，均經(jīng)手術(shù)和病理學(xué)確診。鞍膈或鞍底硬腦膜送病理學(xué)檢查，明確是否存在腫瘤細(xì)胞浸潤。腫瘤最大直徑11～20 mm者7例，21～30 mm者14例，31～40 mm者9例，＞40 mm者12例。符合下列情況之一者可確定為侵襲性垂體腺瘤:(1)Hardy-Wilson分級為Ⅲ級及Ⅲ級以上和C-E期;(2)Knosp分級3級以上;(3)術(shù)中見鞍區(qū)骨質(zhì)破壞，海綿竇內(nèi)壁穿通，竇內(nèi)結(jié)構(gòu)被腫瘤包繞;(4)病理證實鞍膈或鞍底硬腦膜有腫瘤細(xì)胞侵潤。42例患者中侵襲性垂體腺瘤27例 (64．3%)，非侵襲性腺瘤15例 (35．7%)。

1．2 方法

1．2．1 標(biāo)本處理 腫瘤標(biāo)本均取自腫瘤中心部位。取綠豆大小腫瘤標(biāo)本數(shù)塊，0．9%氯化鈉溶液洗凈積血，立即放入經(jīng)焦碳酸二乙酯 (DEPC)水處理過的凍存管中，置液氮中保存。

1．2．2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)檢測垂體腺瘤HIF-1αmRNA的表達(dá) Trizol裂解細(xì)胞后提取總RNA，取1μl測光密度 (OD)值，DNA消化。使用日本Toyobo公司試劑盒逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行cDNA合成。引物 (上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司)序列如下:HIF-1α上游:5′-AAA GAC CGT ATG GAA GAC-3′; 下游:5′-CAA AGCGACAGA TAA CAC-3′;β-actin為內(nèi)參照，上游:5′-CTG TCT GGC GGC ACC ACC AT-3′; 下游:5′-GCA ACT AAG TCA TAC TCC GC-3′。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 體系:cDNA 2μl，Taq酶0．2μl，總反應(yīng)體系20μl。PCR循環(huán)條件:95℃預(yù)變性3 min;以94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次;72℃延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。1．5%的瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠在Eagle Eye-Ⅱ型圖像分析系統(tǒng)上分析計算。測出HIF-1α擴(kuò)增帶的OD值，并以β-actin擴(kuò)增帶的OD值作為參照，得出HIF-1α與β-actin OD值比較的相對比值。

1．2．3 免疫組化檢測垂體腺瘤HIF-1α蛋白的表達(dá) 一抗為鼠抗人HIF-1α單克隆抗體，購自加拿大Chemicon公司，鏈霉卵白素—過氧化物酶 (SP)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，免疫組化操作按試劑盒說明進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，已知陽性組織切片作陽性對照。參照Birner等［2］方法進(jìn)行半定量分級，高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，以陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的得分之和進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞率＜10%記為陰性，不論其染色深淺，記1分;陽性細(xì)胞率11% ～50%記2分，51% ～80%記3分，＞80%記4分。染色強(qiáng)度呈弱染色 (淺黃色)記1分，中等染色 (棕黃色)記2分，強(qiáng)染色 (黃褐色)記3分。上述兩項積分之和為3分者為弱陽性 (+)，4～5分者為中等陽性 (++)，6～7分者為強(qiáng)陽性 (+++)。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以 (±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白的表達(dá) 非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白表達(dá)陽性例數(shù)為9例，陽性率為60．0%(9/15);侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白表達(dá)陽性例數(shù)為26例，陽性率為96．3% (26/27)，兩組陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=9．15，P=0．005，見圖 1、表1)。

2．2 侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1αmRNA的表達(dá)HIF-1αmRNA在侵襲組的表達(dá)量為 (0．298±0．094)，在非侵襲組的表達(dá)量為 (0．241±0．079)，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=1．041，P=0．329，見圖 2)。

圖1 HIF-1α在垂體腺瘤中的表達(dá) (SP×200)Figure 1 Expression of HIF-1α in pituitary adenomas(SP×200)

表1 兩組垂體腺瘤HIF-1α蛋白表達(dá)情況比較 (例)Table 1 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas between two groups

圖2 HIF-1αmRNA 在垂體腺瘤中的表達(dá)Figure 2 mRNA expression of HIF-1αin pituitary adenomas

2．3 不同大小腫瘤HIF-1α蛋白的表達(dá) 根據(jù)影像學(xué)測定垂體腺瘤的最大直徑進(jìn)行比較，垂體腺瘤直徑10～30 mm者HIF-1α蛋白表達(dá)陽性例數(shù)為14例，陽性率為70．0%;直徑＞30 mm者HIF-1α蛋白表達(dá)陽性例數(shù)為21例，陽性率為95．5%，兩組陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4．89，P=0．041，見表2)。

表2 不同大小垂體腺瘤標(biāo)本HIF-1α蛋白表達(dá)情況比較 (例)Table 2 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas with different diameter

3 討論

垂體腺瘤是顱內(nèi)常見的實體性腫瘤，絕大多數(shù)組織學(xué)上呈良性表現(xiàn)，但常向鞍上和鞍旁海綿竇內(nèi)生長，甚至突破鞍底骨質(zhì)，向蝶竇內(nèi)生長，表現(xiàn)出類似惡性腫瘤侵襲的特征。因此，單純從影像學(xué)上難以正確評價垂體腺瘤的生物學(xué)行為。

近年來許多研究表明，腫瘤侵襲行為的產(chǎn)生與HIF-1α表達(dá)和穩(wěn)定性增加有關(guān)，HIF-1α在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況可對腫瘤的惡性程度及侵襲行為的改變進(jìn)行判斷和預(yù)測［3］。

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在垂體腺瘤中有明顯表達(dá)，其表達(dá)部位主要位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也可有少量表達(dá)，這與國外的研究結(jié)果一致［4］。本研究還發(fā)現(xiàn)，在垂體腺瘤發(fā)生囊變壞死區(qū)域的周邊組織以及腫瘤血管分布稀疏的地方，HIF-1α表達(dá)較高。一般認(rèn)為，距離血管100～200μm以外的區(qū)域即處于缺氧環(huán)境中，大部分腫瘤組織氧分壓低于2．5 mm Hg(1 mm Hg=0．133 kPa)，而正常腦組織則為 24 ～ 66 mm Hg［5］，說明缺氧可能是誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)及穩(wěn)定的重要因素。

Semenza［6］及 Sharp 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對 HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)錄后等多個過程，其中對轉(zhuǎn)錄后即在蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)是其主要的調(diào)控方式。Secades等［8］也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織在缺氧早期即有HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的增加，并對其下游靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響腫瘤的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白在侵襲組垂體腺瘤中表達(dá)的陽性率高于非侵襲組，而HIF-1αmRNA在侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中表達(dá)則無差異，這表明缺氧對垂體腺瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)的影響主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)水平。

此外，本研究對不同大小垂體腺瘤中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況也進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，垂體腺瘤直徑＞30 mm者HIF-1α蛋白表達(dá)陽性率較高。有研究表明，氧在腫瘤組織中的彌散不超過10個細(xì)胞的距離，除此之外，其他部位呈現(xiàn)相對或絕對缺氧狀態(tài)［9］。隨著腫瘤體積的增大，上述情況加重，主要原因可能與腫瘤的微血管數(shù)目相對不足有關(guān)。以往研究已經(jīng)證實，垂體腺瘤的微血管密度低于正常垂體組織［10-11］。HIF-1α蛋白在直徑＞30 mm的垂體腺瘤中具有較高程度的表達(dá)，這可能與垂體腺瘤中微血管數(shù)目的相對不足所導(dǎo)致的腫瘤組織缺氧有關(guān)。

綜上所述，HIF-1α蛋白在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)增加，并且在垂體腺瘤侵襲行為產(chǎn)生的過程中可能發(fā)揮重要的作用。

1 陶曉峰，劉暢．缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子與肝細(xì)胞癌分化及其侵襲性的相關(guān)性研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(1):164．

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5 Belozerov VE，Van Meir EG．Hypoxia inducible factor-1:a novel target for cancer therapy［J］．Anticancer Drugs，2005，16(9):901-909．

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