潘海龍

摘要：用MPN法測定不同水分管理、硝化抑制劑條件下稻田土壤硝化菌、亞硝化菌及反硝化菌的數(shù)量變化。水分含量較高（110％WFPS）時(shí)，反硝化細(xì)菌含量較高，達(dá)到160萬個(gè)/g干土；硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌受到抑制，分別只有2.4萬個(gè)/g干土、0.49萬個(gè)/g干土。水分較低（60％WFPS）時(shí)，反硝化細(xì)菌含量減少顯著，僅為17萬個(gè)/g干土；而硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌迅速增加，分別達(dá)到35萬個(gè)/g干土、3.5萬個(gè)/g干土。雙氰胺對稻田土壤亞硝化菌抑制顯著，高濃度（2%）的雙氰胺對硝化菌也有明顯的抑制作用，而對土壤反硝化菌僅有輕微抑制。

關(guān)鍵詞：硝化菌 亞硝化菌 反硝化菌 雙氰胺

Abstract:The nitrobacteria, nitrosobacteria and denitrifying bacteria population were determinded inpaddy soil under different moisture conditions and nitrification inhibitors by MPN enumeration method.The results of which are 1.6×106 denitrifying bacteria,2.4×104 nitrobacteria and 4.9×103 nitrosobacteria per gram in dry soilunder 110%WFPS and 1.7×105 denitrifying bacteria,3.5×105nitrobacteria and 3.5×104 nitrosobacteria per gram in dry soil under 60%WFPS indicated that the number of denitrifying bacteria was very enormous under110%WFPS,but, nitrobacteria and nitrosobateria was restrained.Denitrifying bacteria reduced repidly under 60%WFPS, whereas ,nitrobacteria and nitrosobateria quickly increased. Dicyandiamide could restrain nitrosobacteria significantly,and nitrobacteriawould also be remarkably restrained under high dicyandiamide concentration,while denitrifying bacteria slightly.

Key words: nitrobacteria，nitrosobacteria，denitrifying bacteria，dicyandiamide

中圖分類號： TQ352 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：

1.簡介

氧化亞氮（N20）作為大氣的微量氣體成分之一，近年來受到全球性的關(guān)注。這是因?yàn)镹20除了具有吸收紅外線的性質(zhì)，能減少地表通過大氣向外空的熱輻射，進(jìn)而導(dǎo)致溫室效應(yīng)外，還表現(xiàn)為在平流層中的N20可與D電離層的氧原子發(fā)生反應(yīng)生成NO，并進(jìn)一步與同溫層的臭氧（O3）發(fā)生反應(yīng)，從而消耗O3，破壞臭氧層，導(dǎo)致到達(dá)地球表面的紫外輻射增強(qiáng)，使人類的生存健康受到影響。因此，N20在大氣中濃度的增加及其排放影響因素倍受關(guān)注。[2-5]

在生物形成N20的過程中，微生物的硝化和反硝化作用被認(rèn)為是最基本的機(jī)理。參與硝化、反硝化過程的微生物類群主要包括：硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等。土壤中N20的產(chǎn)生主要來源于土壤微生物參與下的硝化及反硝化反應(yīng)。各種不同的自然條件大都通過影響微生物的數(shù)量和活性來影響土壤N20的釋放。[6]

土壤含水量很低、長期淹水不利于硝化、反硝化細(xì)菌的生長。對稻田土壤來說，土壤水分含水量始終處于較高或很高的狀態(tài)，這時(shí)土壤通氣性就有可能成為微生物活性最重要的制約因素。[10]在無降雨或降雨量較少期間，土壤含水量適中，通氣性良好，土壤硝化作用及反硝化作用都能以較高速率進(jìn)行且以N20為主要產(chǎn)物。當(dāng)降雨量大時(shí)，土壤由于持續(xù)淹水而處于缺氧和強(qiáng)還原狀態(tài)，N20的產(chǎn)生以反硝化為主，但這時(shí)反硝化作用產(chǎn)生的N20可N20還原酶還原為N2，加上水層對N20向大氣擴(kuò)散的及對N20的少量溶解，所以這段期間稻田向大氣排放的N20量很少。

在特定條件下，硝化作用是導(dǎo)致N20、NO生成的主要微生物途徑。亞硝化單胞菌屬在厭氣條件下產(chǎn)生N20，表明硝化作用不是N20的直接來源。通氣土壤，亞硝化單胞菌屬細(xì)菌利用NO2-—作為最終電子受體產(chǎn)生N20。缺乏NO3-，微生物可能還原更多的N20。根分泌物通過消耗根際氧，產(chǎn)生厭氣環(huán)境，可刺激反硝化作用。

此外，植物與土壤的相互作用極大的影響著土壤-植物系統(tǒng)中N20的釋放。一方面植物根系及根系分泌物一定程度上改變了土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，促進(jìn)了土

壤中的微生物過程和N20的產(chǎn)生。[17]研究表明，根的生長不但消耗02、NO3-、NH4+和水，還能改變土壤結(jié)構(gòu)，分泌有機(jī)酸改變根系PH，并提供有機(jī)碳化物刺激微生物活動(dòng)。另一方面，植物根系殘落物和分泌物還會(huì)導(dǎo)致根際反硝化強(qiáng)度的增加，反硝化微生物的活性與根區(qū)含碳物質(zhì)的濃度密切相關(guān)。[18]水稻根有著明顯的向外泌氧的過程，能夠提高周圍環(huán)境的氧化還原電位，進(jìn)而影響到硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的增長、繁殖。[19-21]

目前，對于各種處理?xiàng)l件下稻田土壤N20的排放通量變化及影響因子有較詳盡的報(bào)道。其中硝化-反硝化作用過程的微生物機(jī)理還沒有深入的認(rèn)識，關(guān)于土壤中N20排放量與微生物菌群和數(shù)量的關(guān)系研究的較少。本實(shí)驗(yàn)初步探討不同水肥條件下稻田土壤中氮循環(huán)細(xì)菌菌群的數(shù)量變化，對土壤N20釋放的生物學(xué)機(jī)理研究具有重要意義。[22]

2.材料與方法

2.1試供土壤

試驗(yàn)土壤取自浙江大學(xué)農(nóng)場水稻田，土壤理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)：2.8％，pH值：7.95，采樣后將稻田土壤風(fēng)干、磨細(xì)，過2mm篩備用。

2.2處理與培養(yǎng)

2.2.1處理

實(shí)驗(yàn)分為兩組：低濃度DCD（0.4mg/培養(yǎng)）、高濃度DCD（2mg/培養(yǎng)），每組試驗(yàn)設(shè)4種不同的水分管理模式：淹水（110％WFPS）、臨界飽和水（95％WFPS）、模擬旱地水分（60％WFPS）以及水旱交替（95－60％WFPS），WFPS表示的是土壤孔隙充水率。每種水分條件設(shè)2種施肥方式：施肥（9.9mg尿素/培養(yǎng)，相當(dāng)于154mg－N/kg）、不施肥。

2.2.2培養(yǎng)

稱取30g過2mm篩的風(fēng)干土樣放入250ml有密封蓋的培養(yǎng)器中，在30℃下恒溫培養(yǎng)。雙氰胺與尿素配制成溶液后一起加入。培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)器敞開。干濕交替處理為7天濕（95％WFPS）,7天旱（60％WFPS）交替管理。

2.3采樣與接種

每組培養(yǎng)在預(yù)培養(yǎng)的第5天取樣，水分交替的培養(yǎng)在交替前、后3天采樣接種。其他培養(yǎng)在正式培養(yǎng)的第7天采樣接種。采樣的新鮮土樣制成10-1至10-5的土壤懸浮液，搖勻，分別接種于硝化細(xì)菌培養(yǎng)基、亞硝酸氧化細(xì)菌培養(yǎng)基和反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.結(jié)果與討論

3.1 水分條件對硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的影響

實(shí)驗(yàn)證明，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的數(shù)量主要決定于土壤水分含量。水分含量較高（110％WFPS）時(shí)，稻田土壤中硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌含量很少，分別只有2.4萬個(gè)/g干土、0.49萬個(gè)/g干土，而反硝化細(xì)菌含量卻很高，達(dá)到160萬個(gè)/g干土。當(dāng)水分含量較低（60％WFPS）時(shí)，情況相反，稻田土壤中硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌含量很高，分別達(dá)到35萬個(gè)/g干土、3.5萬個(gè)/g干土，是水分含量為110％WFPS時(shí)硝化細(xì)菌量的15倍 、水分含量為110％WFPS時(shí)亞硝化細(xì)菌的7倍；反硝化細(xì)菌僅為17萬個(gè)/g干土，只有水分含量為110％WFPS時(shí) 的十分之一。由此看出，稻田土壤水分含量的多少與硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌及反硝化細(xì)菌的數(shù)量有直接關(guān)系，是決定土壤中硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌及反硝化細(xì)菌的數(shù)量變化的主要因素。土壤含水量較高（110％WFPS）時(shí)，土壤透氣性降低，處于缺氧狀態(tài)，環(huán)境中氧化還原電位極低，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌由于缺乏電子受體而受到抑制。同時(shí)，由于高水分條件造成的厭氧環(huán)境抑制硝化細(xì)菌的NH4+單氧化酶的活性[5]，造成了土壤中硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌的數(shù)量和活性均較低，硝化作用十分微弱。但是，高水分條件造成的厭氧還原狀態(tài)解除了反硝化細(xì)菌的氧毒害作用，促進(jìn)反硝化細(xì)菌的生長和繁殖，使得反硝化細(xì)菌數(shù)量迅速增加。土壤水分含量低（60％WFPS）時(shí)，土壤通透性好，土壤氧化還原電位較高，處于氧化狀態(tài)，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌數(shù)量迅速增加。高氧化還原電位抑制了反硝化細(xì)菌的生長，反硝化細(xì)菌數(shù)量含量急劇減少。

從絕對數(shù)量上看，亞硝化細(xì)菌在水分適宜（60％WFPS）時(shí)最大數(shù)量為3.5萬個(gè)/g干土數(shù)量，大大低于硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的數(shù)量。這可能與NO2－在土壤中容易轉(zhuǎn)化、不易積累有關(guān)，由于NO2－的缺乏，使得亞硝化細(xì)菌能源供應(yīng)不足，抑制了亞硝化細(xì)菌數(shù)量的增加。

3.2 雙氰胺對硝化菌、亞硝化菌和反硝化菌的影響

圖1在不同雙氰胺濃度下稻田土壤硝化細(xì)菌數(shù)量的變化

圖2在不同雙氰胺濃度下稻田土壤亞硝化細(xì)菌數(shù)量的變化

圖3在不同雙氰胺濃度下稻田土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量的變化

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖結(jié)果可看出，低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤硝化細(xì)菌影響不明顯，高濃度的雙氰胺（2%）卻能夠明顯抑制硝化細(xì)菌的數(shù)量，一般會(huì)降低一個(gè)數(shù)量級左右。這可能與雙氰胺中的氰基和細(xì)菌呼吸酶中的硫氫基或金屬基團(tuán)的反應(yīng)有關(guān)。低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤亞硝化菌較為明顯，高濃度的雙氰胺（2%）對亞硝化菌的抑制作用十分強(qiáng)烈，在60％WFPS水分條件下，2%雙氰胺能夠使得土壤亞硝化細(xì)菌數(shù)量降低達(dá)1.5個(gè)數(shù)量級。低濃度的雙氰胺（0. 5%）對反硝化菌僅有輕微抑制，高濃度的雙氰胺（2%）使這種抑制作用略有增加。雙氰胺對硝化作用的抑制引起阻斷了NH4＋向NO3－的轉(zhuǎn)化，土壤中的NO3－濃度降低，反硝化作用反應(yīng)底物減少，從而造成了對反硝化細(xì)菌的抑制。

4.結(jié)論與展望

結(jié)論：

1.硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌主要決定于土壤水分含量。水分含量較高時(shí)，土壤處于還原狀態(tài)，反硝化細(xì)菌含量較高，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌受到抑制；水分含量較低時(shí)，土壤處于氧化狀態(tài)，反硝化細(xì)菌含量減少，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌迅速增加。硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌主要決定于土壤水分含量。水分含量較高時(shí)，土壤處于還原狀態(tài)，反硝化細(xì)菌含量較高，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌受到抑制；水分含量較低時(shí)，土壤處于氧化狀態(tài)，反硝化細(xì)菌含量減少，硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌迅速增加。侯愛新等對水稻田水分含量變化的試驗(yàn)也表明，土壤含水量較高的淹水期，由于淹水造成的厭氧環(huán)境可以抑制硝化細(xì)菌的NH4+單氧化酶的活性，同時(shí)，反硝化作用則由于氧化還原電位降至0以下，代謝產(chǎn)物主要以N2為主，幾乎沒有N20的凈排放。而落干期，由于可得性氧氣增多，硝化細(xì)菌酶活性抑制被解除，反硝化作用中N20還原酶活性開始受到抑制，代謝產(chǎn)物中，N20/ N2的比例增大。[7-9]

雙氰胺對稻田土壤亞硝化菌產(chǎn)生顯著抑制。

低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤硝化細(xì)菌抑制不顯著，高濃度的雙氰胺（2%）卻能夠明顯抑制硝化細(xì)菌的數(shù)量，一般會(huì)降低一個(gè)數(shù)量級左右。

雙氰胺對土壤反硝化菌僅有輕微抑制，可能是由于雙氰胺對硝化作用NO2-氧化為N03-的抑制，引起作為反硝化作用反應(yīng)底物N03-減少。

展望：

目前，對已經(jīng)開展了對硝化反硝化過程中各種酶的作用機(jī)理研究，但是，研究不夠深入，對于各種酶的生化結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、不同條件下的酶活性及原因等還有待進(jìn)一步作深入研究。

2、分子生物學(xué)的方法對土壤中硝化、亞硝化、反硝化等氮循環(huán)細(xì)菌進(jìn)行在不同條件下細(xì)菌種群、數(shù)量變化、生化特性、分布、活性等進(jìn)行研究。從微生物學(xué)的角度探討稻田土壤中氧化亞氮的形成、釋放機(jī)理。

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