林偉蘭 江 溱

廣西古方藥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530221

肝喜樂片由墩果酸、刺五加浸膏、五味子浸膏等成分組成。功能主治有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，保護(hù)及促進(jìn)肝細(xì)胞再生功能，主要用于治療急性肝炎，遷延型慢性肝炎和肝硬化等癥。齊墩果酸為本方中有效成分之一，因此測定本品中齊墩果酸的含量，可作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，保證藥品使用安全、有效，采用HPLC法測定了齊墩果酸的含量及含量均勻度。

1 儀器與試藥

LC－10AP型高效液相色譜儀 (日本島津公司);SPD－10Avp紫外－可見檢測器;LC－10ATVP7725(i)型手動進(jìn)樣器;威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站;Aglient 8456紫外可見分光光度計;?kh－250db型超聲處理器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

齊墩果酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為:110773－9911;肝喜樂片 (購自A廠，共3批);乙腈為色譜純;其余試劑為分析純，水為超純水。

2 實(shí)驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:十八烷基鍵合硅膠Kromasil C18(4.6×150mm，5um)流動相為乙腈－水－磷酸溶液 (75:25:0.42)，檢測波長:210nm，流速為1.0 ml· min－1，進(jìn)樣量為10μl;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)按齊墩果酸計算應(yīng)不低于1500。在上述色譜條件下，供試品中齊墩果酸能完全分離，對照品與陰性對照品溶液中沒有峰重疊，色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品10.0mg，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得 (每1ml含齊墩果酸0.1 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取0.3g，精密稱定，精密加入25ml甲醇，稱定重量，超聲處理 (功率250W，頻率50kHz)50分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，以上述色譜條件測定，根據(jù)齊墩果酸峰面積，以外標(biāo)法計算供試品中齊墩果酸含量。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液以1、2、3、4、5μl按擬定的色譜條件測定峰面積，以峰面積分值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程:Y=500165 X－5495.3，r=0.9997，結(jié)果表明:齊墩果酸進(jìn)樣濃度在0.592～2.96mg范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與齊墩果酸峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取齊墩果酸對照品溶液和供試品溶液 (批號:20110101)各10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測定齊墩果酸面積，其RSD為1.85%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液 (批號:20110101)10μl，分別于0、4、8、12、16、24小時進(jìn)行測定，其峰面積RSD為1.87%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 陰性對照試驗 按處方比例取處方中缺齊墩果酸，照制法制取陰性樣品。取陰性樣品0.3g，并按供試品溶液提取方法制成陰性對照溶液，測定，在上述色譜條件下，缺齊墩果酸陰性對照溶液，在齊墩果酸譜峰處無干擾峰出現(xiàn)，表明對被測成分無干擾。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批號供試品 (批號:20110101)共5份，每份約1.5g，精密稱定，按樣品測定項下方法進(jìn)行提取，測定，結(jié)果測得平均值0.451 mg·g－1，RSD%=0.20，表明重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的肝喜樂片 (批號20110101)五份，精密加入齊墩果酸對照品適量，制成供試品溶液，按上述色譜測定，以下計算回收率。結(jié)果見表1。

2.11 含量測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液3批，按上述色譜條件測定，以外標(biāo)法計算，結(jié)果見表2。

2.12 含量均勻度測定 取樣品3批，按供試品溶液制備方法提取，以上述色譜條件依法 (2010年版藥典二部附錄XE)測定齊墩果酸含量均勻度，結(jié)果見表2。

表1 齊墩果酸加樣回收試驗結(jié)果

表2 樣品含量及含量均勻度測定結(jié)果

3 討論

3.1 波長的選擇 文獻(xiàn)［1］采用215nm作為檢測波長;而對齊墩果酸對照品溶液進(jìn)行紫外吸收光譜測定，其吸收峰為210nm處的峰面積較大，故選擇210nm作為本品的檢驗波長。

3.2 流動相的選擇 齊墩果酸為弱酸性化合物，在流動相中加入少量酸性物質(zhì)可改善峰形，參考文獻(xiàn)［2］乙腈－水(94∶6)溶液，文獻(xiàn)［3］甲醇 － 水 －冰乙酸 －三乙胺 (87∶13∶0.0 4∶0.0 2)，通過比較兩者不同配比下的分離效果，最終確定為乙腈－0.42%磷酸溶液 (75:25)為流動相，此條件下，從色譜圖形分析看，齊墩果酸托尾因子較小，樣品分離效果好，陰性對照無干擾。

3.3 提取時間的考察 取同一供試品，超聲時間分別為30min，40min，50min，對提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果超聲提取50min時可提取完全，故實(shí)驗中選擇50分鐘作為提取時間。

［1］李喜鳳，郝哲，邱天寶，等.反相高效液相色譜法測定蒲公英中齊墩果酸的含量［J］.中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2010，16(5):52－54.

［2］田園，李曉，關(guān)開，等.RP－HPLC法測定肝喜樂膠囊中齊墩果酸的含量［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，03:345.

［3］張雯婕，管太平，錢世兵.HPLC測定左歸丸中齊墩果酸于熊果酸含量［J］.中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2012，18(5):92－94.