陳積暖，馮曉梅

(海南天煌制藥有限公司，海南 ?？?570203)

鹽酸舍曲林為選擇性抑制5－羥色胺再攝取的抗抑郁藥(SSRI)，目前已成為抗抑郁治療的一線藥和首選藥。鹽酸舍曲林存在4種光學異構體，在合成工藝過程中可能會引入中間雜質(zhì)(順式左旋異構體，反式左旋異構體，反式右旋異構體)。目前其異構體檢測方法為毛細管電泳法(只對順式左旋異構體進行檢測)，其他雜質(zhì)檢測采用反相高效液相色譜法，但主峰與其相鄰異構體峰不能很好分離。筆者參考相關文獻，經(jīng)方法學研究，建立了鹽酸舍曲林有關物質(zhì)的檢測方法[1－2]，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC－10AVP/SPD－10Avp高效液相色譜儀(日本島津);浙大2010色譜工作站。Hypersil ODS2色譜柱(大連伊利特，150 mm×4．6 mm，5 μm)。乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉、β － 環(huán)糊精、HP －β－環(huán)糊精，三乙胺均為分析純;鹽酸舍曲林片(自制，批號為090301，090302，090303，規(guī)格為每片 50 mg;批號為 0812302，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為每片50 mg);鹽酸舍曲林對照品(批號為20070403M，含量99．6%)，鹽酸舍曲林(1R4S)異構體對照品(批號為20060401，含量99．2%)，鹽酸舍曲林(1S4R)異構體對照品(批號為 20060401，含量 98．6%)，鹽酸舍曲林(1R4R)異構體對照品(批號為 20060401，含量 99．8%)，均由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與測定方法

色譜條件:照高效液相色譜法[2005年版《中國藥典(二部)》附錄VD]測定。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以磷酸二氫鈉緩沖液[取磷酸二氫鈉 12．5 g，β － 環(huán)糊精 12．8 g，HP－ β － 環(huán)糊精 17．3 g，加水至 1 000 mL]－ 乙腈 － 三乙胺(800 ∶200 ∶10)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至(2．5±0．5)為流動相;檢測波長為214 nm;流速為1．0 mL/min。鹽酸舍曲林峰與異構體峰的分離度不得小于1．5，理論板數(shù)按鹽酸舍曲林峰計算應不低于2 000。

測定方法:取本品10片，研細，精密稱取適量，用流動相溶解并制成每1 mL中含鹽酸舍曲林1 mg的溶液，搖勻，濾過，作為供試品溶液;另取鹽酸舍曲林順式左旋構體、反式左旋異構體、反式右旋異構體對照品適量，加流動相溶解并制成每1 mL中含鹽酸舍曲林順式左旋構體10 μg和反式左旋異構體、反式右旋異構體各5 μg的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測器靈敏度，使主成分峰高約為滿量程的20%;再精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，鹽酸舍曲林異構體按外標法以峰面積計算，供試品中含順式左旋構體的量不得過1．0%，含反式左旋異構體、反式右旋異構體的量均不得過0．5%。

2．2 溶液配制

取本品10片，研細，稱取約0．35g(相當于鹽酸舍曲林10 mg)，精密稱定，置100 mL的量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。取鹽酸舍曲林順式左旋構體、反式左旋異構體、反式右旋異構體對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含鹽酸舍曲林順式左旋構體10 μg和反式左旋異構體、反式右旋異構體各5 μg的對照品溶液。按處方比例稱取本品輔料混粉適量，照供試品溶液配制方法配制空白輔料溶液。

2．3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗:吸取2．2項下對照品溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，在擬訂的色譜條件下，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果鹽酸舍曲林峰的理論板數(shù)為4 562．6，與鹽酸舍曲林光學異構體峰的分離度為3．56。見圖1 A。結果表明，該色譜條件系統(tǒng)適用性試驗好，能滿足中國藥典規(guī)定的試驗要求。

干擾試驗:取2．2項下空白輔料溶液，在擬訂的色譜條件下，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果保留時間為2．0 min的位置有一小峰出現(xiàn)，但在主峰及其他3個光學異構體峰處未見有吸收峰(見圖1 B)，故輔料對測定不存在干擾。取空白溶劑20 μL，依法注入液相色譜儀，結果試驗所用的溶劑沒有吸收峰(見圖1 C)，故對鹽酸舍曲林及其光學異構體的測定沒有干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性與干擾試驗圖譜

專屬性試驗:取供試品(090301批)細粉約0．35 g，共4份，分別進行以下試驗。加入6 mol/L鹽酸溶液5 mL，室溫放置15 h后，用6 mol/L氫氧化鈉溶液中和(強酸破壞);加入6 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，室溫放置10 h后，用6 mol/L鹽酸溶液中和(強堿破壞);加少量流動相溶解后，置100℃水浴中加熱8 h，放冷(熱破壞);取供試品細粉約0．35 g，加入5%H2O2溶液5 mL，室溫放置15 h(氧化破壞)。將以上溶液分別加流動相稀釋至100 mL，搖勻，濾過，各取20 μL進樣測定，記錄色譜圖。結果各溶液色譜中鹽酸舍曲林峰與各雜質(zhì)峰分離度分別為 2．553，2．663，2．856，2．993，見圖2?？梢?，建立的色譜條件能分離破壞主要產(chǎn)物。

圖2 破壞性試驗圖譜

進樣精密度試驗:分別精密稱取鹽酸舍曲林4個光學異構體對照品，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含鹽酸舍曲林、順式左旋構體各10 μg，反式左旋異構體、反式右旋異構體各5 μg的混合對照品溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。結果鹽酸舍曲林有關物質(zhì)1R4S，1S4R，1S4S，1R4R峰面積的平均值分別為 445 595．1，444 615．7，875 248．0，928 359．5，RSD分別為 1．6%，1．1%，0．4% ，1．4%(n=6)，表明儀器進樣精密度良好。

有關物質(zhì)定位試驗:分別精密吸取鹽酸舍曲林4個光學異構體對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果鹽酸舍曲林4個光學異構體1R4S，1S4R，1S4S，1R4R的保留時間分別為22．929，26．261，31．960，36．052 min。

線性關系考察:分別精密稱取鹽酸舍曲林4個光學異構體對照品，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含鹽酸舍曲林、順式左旋構體各100 μg，反式左旋異構體、反式右旋異構體各50 μg的混合貯備溶液，分別精密量取溶液 0．1，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2，1．4 mL，置 10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取 20 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣量(μg)為橫坐標、峰面積為縱坐標求得回歸方程。結果見表1。

表1 鹽酸舍曲林有關物質(zhì)線性回歸方程及 r值

定量限確定:取鹽酸舍曲林4個光學異構體對照品適量，用流動相配制成一定質(zhì)量濃度，逐級遞減稀釋，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。經(jīng)測定，按信噪比約10∶1計，1R4S，1S4R，1S4S，1R4R 定量限為 6，4．8，4．4，6 ng，且其結果具一定精密度。見表2。

表2 鹽酸舍曲林4個光學異構體定量限(精密度試驗)結果

2．4 樣品檢測結果

取本品，照擬訂的方法測定，采用外標法測定鹽酸舍曲林的3個光學異構體。結果見表3?？梢?，3批自制樣品及上市樣品有關物質(zhì)檢測結果均符合規(guī)定。

表3 樣品光學異構體測定結果(外標法)

3 討論

參照鹽酸舍曲林質(zhì)量標準[3]有關物質(zhì)項下的色譜條件，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸緩沖液(取磷酸10 mL，三乙胺3 mL，加水至1 000 mL)－甲醇－乙腈(40∶60∶10)為流動相，檢測波長220 nm，結果鹽酸舍曲林4個光學異構體色譜峰彼此相互重疊，得不到分離;參照文獻[4]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鈉緩沖液(含0．17 mol/L磷酸鈉、10．5 mmol/L HP－β－環(huán)糊精)－乙腈(68∶32)為流動相，檢測波長225 nm，結果鹽酸舍曲林1R4S與1S4R兩個異構體完全重疊，與其他異構體色譜峰能得到很好的分離。通過試驗摸索可知，流動相體系含有HP－β－環(huán)糊精時可使鹽酸舍曲林光學異構體1S4S和1R4R與1R4S和1S4R得到分離，故參照文獻[5]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸二氫鈉緩沖液(含0．02 mol/L磷酸二氫鈉、10 mmol/L HP－β－環(huán)糊精、10 mmol/L β－環(huán)糊精)－乙腈(80 ∶20)為流動相，檢測波長 214 nm，流速 1．5 mL/min。此時鹽酸舍曲林4個光學異構體色譜峰之間能得到很好的分離，但供試品溶液主峰峰形寬大，且各峰保留時間較長，流速較大，會造成柱壓過高。因此對色譜條件進行了優(yōu)化，磷酸二氫鈉濃度改為80 mmol/L，增加了HP－β－環(huán)糊精及β－環(huán)糊精的溶解度，穩(wěn)定了藥物所形成的包合物，加入了三乙胺(含量1%)減輕和消除峰拖尾現(xiàn)象，同時稍增加了HP－β－環(huán)糊精(11 mmol/L)及β－環(huán)糊精(11 mmol/L)的濃度，使保留時間得到提前。因HP－β－環(huán)糊精及β－環(huán)糊精對順式及反式異構體識別能力的強弱不一致，兼顧分離度和色譜峰形，選擇流速為1．0 mL/min。

方法學考察結果顯示，所選方法適合于本品光學異構體的檢測要求。由于鹽酸舍曲林存在4種光學異構體，目前其異構體檢測方法為毛細管電泳法和手性柱進行折分[6]，價格昂貴，且手性柱不容維護、通用性差;采用常規(guī)的反相色譜法，4個光學異構體彼此重疊而不能分離，沒法控制本品的質(zhì)量。采用反相色譜法，在流動相系統(tǒng)中加入HP－β－環(huán)糊精及β－環(huán)糊精，可以在同一色譜條件中拆分4種光學異構體[7]，使其操作簡便、快速、分離效果好，比較經(jīng)濟，較手性固定相法和毛細管電泳法普及。但由于其流動相系統(tǒng)酸性較強，HP－β－環(huán)糊精及β－環(huán)糊精容易造成柱子堵塞，使柱壓升高，色譜柱容易損傷，因此試驗后需花較長時間清洗色譜柱。建議在選擇色譜柱時，選擇一些耐酸性較強的色譜柱。

[1]蘇立強，李 沖，張曉紅，等．高效液相色譜流動相添加劑法拆分頭孢氨芐對映體[J]．藥物分析雜志，2008，28(6):921－923．

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)[M]．北京:化學工業(yè)出版社，2005:附錄XIX A．

[3]YBH24572005，國家藥品標準·鹽酸舍曲林[S]．

[4]陳德英，陳玉英，胡育筑．HP－β－環(huán)糊精對鹽酸舍曲林異構體手性選擇包合和色譜保留行為影響的研究[J]．色譜，2004，22(6):595－600．

[5]孫 山，黃 信．HPLC法測定鹽酸舍曲林有關物質(zhì)研究[J]．四川醫(yī)學，2005，26(7):761 －762．

[6]WS1－(X－452)－2003Z，國家藥品標準·新藥轉正標準(第47冊)鹽酸舍曲林片．

[7]寧鳳容，黃可龍，焦飛鵬．HP－β－CD手性流動相HPLC法拆分萘普生對映體的色譜保留機制和拆分機理研究[J]．化學通報，2006，69(6):425．