楊 磊，劉光軍，王 謙，張大偉，譚 琪，高志剛

目前同種異體骨已成為臨床修復(fù)節(jié)段性骨缺損的首選方法，但隨著應(yīng)用的廣泛，一些單純利用異體骨處理技術(shù)手段難以解決的問題也暴露出來，如免疫排斥、晚期感染、移植骨愈合緩慢等。隨著異體骨制備工藝水平的提高，對異體骨移植后生物相容性機制、骨傳導(dǎo)機制、骨誘導(dǎo)機制及大段異體骨移植生物力學(xué)研究的深入，更重要的是分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)、組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過更好的處理方法使異體骨在生物學(xué)特征、理化性能等方面接近或達(dá)到理想骨替代材料的要求成為可能。這種可能具體表現(xiàn)在復(fù)合異體骨移植的研究和應(yīng)用，主要包括以下幾種：①異體骨與組織學(xué)技術(shù)相結(jié)合-復(fù)合自體紅骨髓移植；②異體骨與骨組織工程技術(shù)相結(jié)合-復(fù)合種子細(xì)胞、細(xì)胞因子移植；③異體骨與顯微外科技術(shù)相結(jié)合-異體骨復(fù)合帶血管的骨瓣、骨膜瓣移植?，F(xiàn)綜述如下。

1 復(fù)合自體紅骨髓的同種異體骨移植

自體紅骨髓是最早被應(yīng)用于復(fù)合骨移植的成骨活性物質(zhì)。隨著組織學(xué)研究的進展，現(xiàn)已知自體紅骨髓的成骨活性主要來源于骨髓基質(zhì)和骨祖細(xì)胞。骨祖細(xì)胞有兩大類：①誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞（inducible osteogenic precursor cell，IOPC）：為未分化的間葉細(xì)胞，存在于所有結(jié)締組織中，在骨形成蛋白等生長因子作用下可轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞系；②定向骨祖細(xì)胞（determined osteogenic precursor cell，DOPC）：僅存在于骨髓基質(zhì)和骨表面上，由骨髓多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，為已分化的骨系。骨髓是唯一含有豐富的定向性和誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞的組織，且骨髓間葉細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨活性最強。骨髓中的單核細(xì)胞和血小板等也能產(chǎn)生多種生長刺激因子，具有促進骨修復(fù)的作用。

單純的紅骨髓移植具有操作安全、簡單、費用低、創(chuàng)傷小的優(yōu)點，臨床應(yīng)用于治療骨折延遲愈合及不愈合獲得較好的治療效果。但是骨髓具有一定的流動性，單純植入后易擴散，不能在植入部位形成有效濃度，也不能提供力學(xué)的穩(wěn)定性，降低了其成骨效果。同種異體骨作為骨髓的載體避免了截取自體骨的并發(fā)癥，并具有組織相容性好、結(jié)構(gòu)與宿主骨相近、適于血管進入和細(xì)胞吸附等優(yōu)點。

Bruwell[1，2]最早設(shè)計了此類研究的動物實驗，即將除去骨髓的新鮮同種髂骨用自體紅骨髓浸泡，制成新鮮同種自體復(fù)合骨移植于肌肉，結(jié)果此復(fù)合骨具有與同種髂骨相同的成骨能力，而單獨移植自體紅骨髓于肌肉則只有43%的動物有新骨形成。趙家駒等[3]利用異體松質(zhì)骨復(fù)合自體紅骨髓移植治療粉碎性骨折、骨缺損和骨不連56例，獲得8個月以上隨訪的28例均骨性愈合。胡懿郃等[4]應(yīng)用同種異體脫鈣骨與自體紅骨髓復(fù)合移植治療58例66處長骨良性腫瘤刮除后骨缺損，術(shù)后隨訪42例49處骨缺損，隨訪時間1～3年，49處骨缺損均在9個月內(nèi)骨性愈合，平均時間為6個月，優(yōu)良率93%?？字緞偟萚5]應(yīng)用同種異體松質(zhì)骨復(fù)合自體紅骨髓移植治療創(chuàng)傷性骨缺損38例。結(jié)果，38例切口均Ⅰ期愈合。復(fù)查X線片示36例達(dá)骨性愈合，1例感染性骨缺損移植后遲發(fā)性感染，去除內(nèi)固定及同種異體骨，置管沖洗、局部穩(wěn)定后再次植骨愈合，隨訪25個月骨感染未復(fù)發(fā)；1例鋼板松動致骨折未愈合，再次行內(nèi)固定、自體骨移植后骨折愈合。根據(jù)Mankin等和Komender等標(biāo)準(zhǔn)評定，滿意36例，不滿意2例。印衛(wèi)鋒等[6]應(yīng)用同種異體骨材料復(fù)合自體濃縮紅骨髓移植治療良性骨腫瘤和瘤樣病變108例，采用異異體骨材料復(fù)合自體濃縮紅骨髓移植52例（復(fù)合紅骨髓植骨組），單純異體骨移植56例（單純植骨組），100例患者達(dá)骨性融合（復(fù)合紅骨髓移植組49例，單純植骨組51例），并獲得24個月隨訪。復(fù)合紅骨髓植骨組移植骨界限模糊時間和消失時間均短于單純植骨組，骨密度也高于單純植骨組（P=0.05～0.01）。術(shù)后3、6、12個月時復(fù)合紅骨髓植骨組骨密度高于單純植骨組（P=0.05～0.01）。復(fù)合紅骨髓植骨組2例，單純植骨組3例出現(xiàn)排異反應(yīng)，使用免疫抑制劑治療二三周后痊愈。

2 復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的同種異體骨移植

骨組織工程的發(fā)展為骨缺損的治療提供了全新的思路。骨組織工程的概念可以定義為：通過將一定密度的種子細(xì)胞植入生物相容性良好，可降解吸收的支架材料中，并輔以適當(dāng)?shù)纳L因子，通過一定時間的體外培養(yǎng)，然后將這種復(fù)合骨植入到受損傷的部位以達(dá)到修復(fù)損傷的目的。

2.1 種子細(xì)胞 早期的研究通常將成骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，因為骨的生長是由成骨細(xì)胞向周圍分泌機制和纖維將自身包埋于其中，形成類骨質(zhì)，在鈣鹽沉積后礦化成骨。成骨細(xì)胞易存活，來源廣泛，有一定的增殖能力，但存在的最大問題是提取的問題，會對細(xì)胞供體必不可避免的造成損傷。

隨著細(xì)胞工程和基因研究的進展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進入了人們的視野。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)條件下具有定向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。因其來源不受限，取材簡單，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，且具有強大的體外分裂增殖能力及較短的細(xì)胞培養(yǎng)周期，隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，BMSCs已成為公認(rèn)的種子細(xì)胞首選。

趙謙等[7]用自體BMSCs復(fù)合異體松質(zhì)骨基質(zhì)修復(fù)兔橈骨節(jié)段性缺損，結(jié)果表明自體BMSCs-異體松質(zhì)骨基質(zhì)復(fù)合物在骨缺損愈合過程中其成骨量、成骨速度及時間均優(yōu)于單純異體松質(zhì)骨移植。柴崗等[8]將自體BMSCs與部分異體脫鈣復(fù)合構(gòu)建的組織工程骨用于修復(fù)顱骨和頜面骨缺損11例，結(jié)果，術(shù)后3～6個月能形成組織工程化骨，并修復(fù)骨組織缺損，術(shù)后1～2.5年隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在，無明顯骨吸收現(xiàn)象。楊柏林等[9]將同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原海綿修復(fù)兔橈骨缺損，建立兔橈骨缺損（1.5 cm）模型，45只新西蘭大白兔隨機分為3組：同種異體BMSCs/CS組（A組），單純膠原海綿組（B組），空白對照組（C組）。結(jié)果：eGFP標(biāo)記的BMSCs異體移植存活時間超過3周。X線片示12周A組大白兔5只中有4只達(dá)到骨性連接。新生骨量呈A組-C組遞減，至12周無一愈合。隨著時間推移，A組編織骨髓腔和骨小梁增多，修復(fù)過程優(yōu)于B、C組。A組生物力學(xué)指標(biāo)均低于健側(cè)正常對照組，但各指標(biāo)能達(dá)到正常組的80%～90%。結(jié)論：同種異體BMSCs復(fù)合CS可以修復(fù)1.5 cm兔橈骨缺損。方志輝等[10]從選取的有關(guān)生物材料復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的實驗中，證實了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以和多種生物材料有效復(fù)合，并可以向成骨細(xì)胞分化。提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進各種支架材料修復(fù)骨缺損的新骨成骨能力。

2.2 支架材料 目前骨組織工程研究報道中，同種異體脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）用于組織工程骨支架材料報道較多。這是由于同其它無機、有機材料相比較，DBM在細(xì)胞相容性、組織相容性、理化性能和生物安全性方面具有一定的優(yōu)勢，保留了部分新鮮骨的骨誘導(dǎo)活性；具體表現(xiàn)在：①DBM的加工工藝成熟簡便；②具有極低的免疫原性、良好的細(xì)胞相容和組織相容性的同時還具有消毒后保持其骨誘導(dǎo)能力的特性；③本身具有一定力學(xué)強度，通過改變脫鈣率可以改變其力學(xué)強度，以適應(yīng)臨床不同植骨部位的需求；④通過采集前病原學(xué)檢查和相應(yīng)的加工處理，可保持其具有良好的生物安全性。

來源于人體的DBM具有天然的網(wǎng)孔樣結(jié)構(gòu)，符合人體正常的生理要求，且材料可隨成骨的進展逐步降解吸收，降解的過程中不會產(chǎn)生對受體及局部成骨有害的酸性代謝產(chǎn)物。

Kasten等[11]對部分脫鈣的羥基磷灰石（HA）、β-磷酸三鈣（β-TCP）和DBM從種子細(xì)胞的粘附率、長入支架內(nèi)部的數(shù)量、增殖和分化效率等方面作過比較，認(rèn)為DBM效果最佳。Tsuang等[12]將大鼠的成骨細(xì)胞與天然的Pyrost骨體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果Pyrost骨不僅有利于成骨細(xì)胞的粘附，而且還促進骨細(xì)胞增殖。Hofman等[13]將成骨細(xì)胞分別與2種不同理化方法處理的天然異種骨Laddec骨和Bio-Oss骨體外復(fù)合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，前者周圍形成的礦化骨量比后者多15%，表明Laddec骨可以為成骨細(xì)胞提供更加適宜的成骨環(huán)境。Zhang等[14]的研究表明未脫鈣骨無誘導(dǎo)成骨活性，當(dāng)鈣殘留量為脫鈣骨基質(zhì)質(zhì)量的2%時，誘導(dǎo)的新生骨量最多，低于1.2%時則誘導(dǎo)成骨量下降。因為脫鈣骨基質(zhì)中保留適當(dāng)?shù)腃a可成為新生骨的鈣化核心，為磷酸鈣的沉積提供晶核。Andre等[15]的研究表明膠原在無細(xì)胞的培養(yǎng)液中可有礦物質(zhì)的沉積，過度洗滌膠原或磷含量低于0.01%將完全抑制礦物質(zhì)在膠原上的沉積，膠原內(nèi)加入磷酸鹽可恢復(fù)其礦化能力，說明磷酸鹽是一個潛在的礦化中心。

據(jù)上述研究可知：作為組織工程支架的同種異體骨的制備原則是：既要有適當(dāng)?shù)牡V物質(zhì)脫出，以利于更多的BMP釋放；又要保留適當(dāng)?shù)拟}磷化合物，以利于更多的礦化新生骨。

李裕標(biāo)等[16]研究了DBM作為組織工程骨支架的可能性；楊志明等[17]采用特殊理化方法制的三種同種異體骨支架材料，均具有良好的細(xì)胞相容性、組織相容性和成骨作用；楊志明等[18，19]還將組織工程肋骨用于臨床移植治療，效果較好。劉順振等[20]，總結(jié)骨組織工程支架材料的研究進展，并展望其發(fā)展趨勢。認(rèn)為，支架材料是構(gòu)建組織工程骨的主體，行使細(xì)胞外基質(zhì)的功能，包括為組織細(xì)胞的修復(fù)活動提供適宜的微環(huán)境，抵擋來自周圍組織的壓力，用于承重部位暫時行使部分功能等。目前人工合成材料和天然材料各有優(yōu)缺點。人工合成材料現(xiàn)存問題主要在于材料的細(xì)胞粘附率低，難以完全降解，致畸性和致癌性有待明確；天然材料則需要更好地解決材料的抗原性和機械性能的關(guān)系，降解速度的調(diào)控問題。充分了解現(xiàn)有材料的特點為尋找新方法及新材料提供理論依據(jù)。段禮府等[21]，探尋異種脫鈣骨基質(zhì)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合植入乳突腔的成骨效能。利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離近交系雌性豚鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，牛股骨頭松質(zhì)骨制備牛髂骨脫鈣骨基質(zhì)。結(jié)論：異種脫鈣骨基質(zhì)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合植入乳突腔能有效促進乳突填塞后骨的形成。

3 復(fù)合細(xì)胞因子的同種異體骨移植

復(fù)合同種異體骨支架材料進行移植的細(xì)胞因子報道最多的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。BMP自1965年發(fā)現(xiàn)以來，已被大量實驗證明有誘導(dǎo)成骨作用，且是唯一能夠單獨誘導(dǎo)骨組織形成的局部生長因子。BMP作用機制為：在一定條件下能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進骨細(xì)胞的生長增殖。

BMP在骨組織中的含量極少（約1 mg/kg濕骨），且在體內(nèi)擴散很快，容易被蛋白酶所分解，因此不能在局部發(fā)揮持續(xù)刺激和誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)成骨作用難以充分發(fā)揮，故必須與一定的載體相結(jié)合才可以。隨著基因重組技術(shù)的進步，BMP的生成、提取及純化技術(shù)越來越成熟，已有多種商品化的BMP面市。

與BMP符合的同種異體骨常用的有：脫蛋白骨（deproteined bone，DPB）、煅燒骨、DBM 及將 DBM 進一步利用化學(xué)方法加工而成的脫礦骨基質(zhì)膠 （demineralized bone matrix gel，DBG）， 又稱為骨基質(zhì)明膠 （bone matrix gelatin，BMG）。BMG中徹底去除了BMP之外95%的非膠原性蛋白質(zhì)和脂類，使其抗原性進一步下降，與BMP復(fù)合具有更高效的、更恒定的骨誘導(dǎo)作用，是公認(rèn)的較理想的骨修復(fù)材料。

Kirker用綿羊的異體DBM復(fù)合rhBMP-2修復(fù)2.5 cm的骨缺損，術(shù)后2～4周即可從X線片上見到新骨形成，52周髓腔再通，為異體骨移植中應(yīng)用BMP提供了實驗依據(jù)[22]。曹瑋等[23]，應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合物聯(lián)合自體紅骨髓移植治療四肢良性骨腫瘤與瘤樣病變32例，32例在6～13月達(dá)到骨性愈合標(biāo)準(zhǔn)，平均8.6個月，移植骨與宿主物界限消失多在10個月后。

除BMP外還有許多生長因子參與骨代謝。孫玉鵬等[24]將轉(zhuǎn)化生長因子（transforming groth factor，TGF-β）負(fù)壓吸引到部分脫蛋白骨上，凍干后植入兔橈骨1.0 cm節(jié)段性缺損，術(shù)后12周骨缺損完全修復(fù)。

早期研究證明TGF-β只有在BMP存在的情況下，才能誘導(dǎo)成骨。近年來研究發(fā)現(xiàn)BMP有40多種，除BMP-1是原膠原C端蛋白酶外，其余均屬于TGF-β超家族的成員。BMPs各成員誘導(dǎo)成骨能力不同，其中BMP-2和BMP-7誘導(dǎo)成骨活性最強。2001年經(jīng)FDA批準(zhǔn)的商品化的rhBMPs即為 rhBMP-2（INFUSE）和 rhBMP-7（OP-1）。

王銳等[25]，骨重建涉及一系列成骨細(xì)胞（OB）和破骨細(xì)胞（OC）的信息交換，是一個由循環(huán)激素局部因子共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要作用。

4 復(fù)合帶血管的自體骨瓣、骨膜瓣復(fù)合異體骨移植

4.1 帶血管的腓骨瓣 隨著顯微外科技術(shù)的不斷發(fā)展，吻合血管的自體腓骨移植修復(fù)骨缺損得到了較廣泛的應(yīng)用。吻合血管的自體骨移植含有成骨活性的骨細(xì)胞，有獨立和豐富的血供，其愈合過程由爬行替代轉(zhuǎn)化為一般的骨折愈合過程，愈合時間短，成功率高，能一期修復(fù)骨缺損，是公認(rèn)的最佳骨移植方法。但因其數(shù)量有限、結(jié)構(gòu)缺陷、不能早期負(fù)重、不可避免的對受體副損傷，應(yīng)用于四肢大段骨缺損的修復(fù)有一定的局限性。

帶血管的自體腓骨瓣與大段異體骨有兩種組合方式即：捆綁式和嵌套式。嵌套式復(fù)合移植因帶血管的腓骨瓣套疊在長段同種異體骨骨髓腔內(nèi)，更使復(fù)合骨移植形成一個“全方位、多形式”的愈合。

Moran等[26]應(yīng)用自體腓骨與異體骨復(fù)合移植對7例下肢惡性骨腫瘤患者進行保肢手術(shù)，隨訪2～6年，平均骨愈合時間為9個月，無一出現(xiàn)感染或異體骨骨折，保肢成功率100%。楊運發(fā)等[27]對帶血管的自體腓骨與異體骨復(fù)合移植進行了系列研究，并在修復(fù)四肢長管狀骨缺損中取得了較好了臨床效果。陳灼彬等[28]，應(yīng)用吻合血管腓骨皮瓣組合異體骨移植治療下肢軟組織伴大段骨缺損，自體骨與異體骨愈合良好，可改善患肢功能并減少傷殘率。

4.2 帶血管的骨膜瓣 骨膜分為外骨膜和內(nèi)骨膜，外骨膜組織學(xué)上分為淺層的纖維層及深層的生發(fā)層，纖維層含有骨膜的固有血管，生發(fā)層細(xì)胞為具有終身分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，在局部血供好、氧分壓高的環(huán)境中分化為成骨細(xì)胞、使骨膜成骨，在局部血供差、氧分壓低的環(huán)境中分化成軟骨細(xì)胞、使骨膜成軟骨，此外局部應(yīng)力因素也對生發(fā)層細(xì)胞的分化有重要影響。

帶血管骨膜瓣移植能顯著改善受區(qū)血供，具有確切的成骨能力，且可根據(jù)受區(qū)情況塑形，與骨瓣移植相比優(yōu)點顯著，隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，眾多新的骨膜瓣供區(qū)被發(fā)現(xiàn)，廣泛應(yīng)用于臨床治療骨不連、陳舊性骨折、骨缺血壞死和骨缺損修復(fù)等[29，30]。

帶血管骨膜瓣對大段異體骨愈合的促進作用，主要表現(xiàn)在：帶血管骨膜瓣不僅能為大段異體骨帶有良好的血運，而且具有很強的成骨作用。

首先，骨膜瓣具有顯著的促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及毛細(xì)血管生成的作用，從而促進大段異體骨的血管化，加速大段異體骨中部的活化。其次，自體宿主骨向異體骨的爬行替代，依靠髓內(nèi)和髓外二種途徑，即一是由自體宿主骨外膜、異體骨周圍肌肉間充質(zhì)組織伴隨著毛細(xì)血骨的長人，帶來骨母細(xì)胞，形成橋梁骨痂，二是由髓內(nèi)成骨細(xì)胞從宿主端向移植骨內(nèi)移動、爬行，而形成內(nèi)骨痂，而前者占主導(dǎo)作用。因此以骨膜瓣復(fù)合異體骨移植，間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，新生骨痂的數(shù)量及速度顯著提高。再次，骨膜瓣內(nèi)會產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如BMP、VEGF、TGF等，帶血供骨膜包裹異體骨，可以較快地使移植物納入與宿主一致的生理反饋模式中，因此具有良好的骨生成、骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)的作用。

張峰等[31]通過動物實驗證明帶血管骨膜瓣對異體骨血管化有明顯促進作用。王劍利等[32]，采用自體帶血管骨（膜）與同種異體骨組合移植治療長段骨缺損，可改善大段異體骨移植的骨吸收、骨不連等并發(fā)癥，有利于骨折的早期愈合，為治療長段骨缺損較為理想的方法。陳磊等[33]，探討雙鋼板加骨間返動脈蒂尺骨上段骨膜瓣逆向轉(zhuǎn)位治療肱骨遠(yuǎn)端骨折不愈的效果。認(rèn)為，雙側(cè)重建鋼板聯(lián)合骨間返動脈為蒂的尺骨上段骨膜瓣逆向轉(zhuǎn)位治療肱骨遠(yuǎn)端骨不連能促進骨折愈合。孟憲勇等[34]，利用以帶蒂筋膜瓣為膜材料應(yīng)用膜引導(dǎo)性骨再生技術(shù)修復(fù)大段骨缺損，能有效限制纖維結(jié)締組織長入，具有效快速血管化能力，極大地加快了移植骨轉(zhuǎn)化為自體骨的速度及效果。胡振順等[35]，以帶蒂筋膜瓣為屏障膜具有MGBR作用，其包裹NTEB應(yīng)用MGBR技術(shù)對促進ECSD修復(fù)療效顯著。

總而言之，異體骨復(fù)合移植的方法很多，各種方法有自己的特點、原理和注意事項。我們在實際臨床應(yīng)用中，只有針對患者的具體病情選擇合適的復(fù)合方法，才會取得較好的治療效果。

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