徐曉云，李冬斌，李 彬

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000;2河北醫(yī)科大學(xué))

核轉(zhuǎn)錄子κB(NF-κB)在炎癥性腸病(IBD)的發(fā)生發(fā)展過程中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。2007年3月～2008年12月，本研究通過合成NF-κB decoy寡核苷酸(ODNs)并轉(zhuǎn)染，對(duì)LPS誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞NF-κB的活化進(jìn)行干預(yù)，用TransAMTM法測(cè)定了細(xì)胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性，觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料和試劑 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購自上海麥莎生物科技有限公司，大腸桿菌(E.colioll:B4)購自Sigma公司。Trizol試劑以及陽離子Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自美國 Invitrogen公司。RPMI1640購自美國Gibco公司，BCA-Protein Assay kit購自晶美生物工程有限公司，TransAM NF-κB p65 kit購自晶美生物工程有限公司，兔抗人NF-кB p65單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 ODNs 序列設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)［1，2］設(shè)計(jì) ODNs 序列，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。NF-κB decoy ODNs:5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'和3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5';Scrambled decoy ODNs:5'-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-3'和3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SW480細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液含10%熱滅活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 每次轉(zhuǎn)染前退火，將互補(bǔ)的兩條單鏈ODNs合成雙鏈ODNs(ds-ODNs):將等摩爾的互補(bǔ)單鏈脫氧ODNs混合，98℃水浴5 min，緩慢降至室溫，形成 ds-ODNs，－20℃保存。根據(jù) Lipofectamine2000試劑盒說明書處理 ds-ODNs。細(xì)胞隨機(jī)分為5組。對(duì)照組:不作處理;脂多糖(LPS)組:LPS(10μg/L)刺激3 h;NODN組:LPS(10μg/L)刺激3 h后轉(zhuǎn)染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs 6 h;SODN組:LPS(10μg/L)刺激3 h后轉(zhuǎn)染1μmol/L的Scrambled ODNs 6 h;Lipofectamine2000組:LPS(10μg/L)刺激 3 h后加入同等劑量 Lipofectamine2000 6 h。

1.5 細(xì)胞核蛋白的提?。?］常規(guī)培養(yǎng)SW480細(xì)胞，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗細(xì)胞2次，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管，細(xì)胞再用PBS洗1次，3 000 r/min離心3 min，棄去PBS，打散細(xì)胞，－80℃冷凍5 min，以200μL緩沖液A重懸細(xì)胞，加0.2 mmol/L的PMSF，加Leupeptin至終濃度10μg/mL，吹打細(xì)胞，冰上放置2 min。加20μL的1%NP-40，旋渦振蕩10 s，5 000 r/min離心30 s，吸上清，沉淀物重懸在50μL預(yù)冷緩沖液C中，加10μg/mL的Leupeptin、0.5 mmol/L 的 PMSF，4 ℃振搖15 min，13 000 r/min離心5min，吸上清后移至新的1.5 mL管中，－70℃保存。取少量核蛋白用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。所有操作在冰浴中進(jìn)行。

1.6 細(xì)胞核 NF-κB p65蛋白檢測(cè) 采用 Western blot法。將提取的各組細(xì)胞核蛋白以50μg/孔上樣，12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。后者在含5%脫脂奶粉的TBS中37℃封閉90 min，用TBS沖膜1次，加一抗(兔抗人NF-κB p65單克隆抗體)，4℃孵育過夜，TBS漂洗(10 min×3次);加二抗，37℃作用40 min，TBS漂洗(10 min×3次)?；瘜W(xué)熒光法顯色。以G3PDH蛋白作內(nèi)參照。曝光獲取圖像。將顯色條帶掃描至計(jì)算機(jī)，凝膠分析軟件對(duì)其進(jìn)行半定量分析。用(目的條帶的面積×熒光強(qiáng)度/G3PDH蛋白條帶的面積×熒光強(qiáng)度)×100%來表示目的蛋白的相對(duì)含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 細(xì)胞核NF-κB p65 DNA結(jié)合活性檢測(cè)［4］采用 TransAMTM法。TransAMTMNF-κB p65 kit內(nèi)含 1個(gè)96孔板，每孔固定有 NF-κB共同序列的 ODNs(細(xì)胞核內(nèi)活化的NF-κB可以特異地結(jié)合到ODNs。只有當(dāng)NF-κB活化且結(jié)合到它的靶DNA時(shí)，用來檢測(cè)NF-κB的一抗才可以識(shí)別p65上的抗原決定簇)。將凍存的細(xì)胞核提取物置于冰上，每個(gè)樣品取5μg，稀釋至終體積20μL;取96孔板，每孔加30 μL的Complete Binding Buffer及樣品稀釋液20μL。薄膜覆蓋密封96孔板，室溫下100 r/min振蕩1 h;傾去液體，每孔用200μL的Washing Buffer漂洗3次，濾紙吸干殘存液體;1∶1 000稀釋NF-κB p65抗體(一抗)，每孔加一抗稀釋液100μL，覆蓋密封平板，室溫下靜置1 h。洗板3次，吸干殘存液體;每孔加1∶1 000的HRP標(biāo)記二抗，密封，室溫靜置1 h。加入二抗后取出保存的展呈液置于室溫下，洗板4次。每孔加100μL的展呈液，室溫避光靜置5 min，直至培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钏{(lán)色時(shí)，每孔加100μL的Stop Solution，藍(lán)色變?yōu)辄S色，全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光度值(A值:表示被測(cè)樣品NF-κB DNA結(jié)合活性)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPPS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多均數(shù)比較用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的含量比較細(xì)胞核中NF-κB p65的相對(duì)含量在對(duì)照組為10.1%±3.2%、LPS 組為 91.3% ±17.8%、NODN 組為86.5% ±13.4%、SODN 組為 90.2% ±14.9%、Lipofectamine2000組為 89.7% ±15.1%;LPS 組、NODN組、SODN組、Lipofectamine2000組與對(duì)照組相比，P均 ＜0.01;LPS組、NODN 組、SODN 組、Lipofectamine2000組組間相比，P均＞0.05。

2.2 各組細(xì)胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性比較細(xì)胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性(A值)在對(duì)照組為 0.124 ±0.210、LPS 組為 1.547 ±0.110、NODN組為 0.327 ±0.053、SODN 組為 1.509 ±0.172、Lipofectamine2000 組為 1.497 ± 0.167;LPS組、NODN組、SODN組、Lipofectamine2000組與對(duì)照組相比，P均＜0.01;NODN組與 LPS、SODN組、Lipofectamine2000組相比，P均＜0.01;SODN組與Lipofectamine2000 組相比，P ＞0.05。

3 討論

NF-κB 是一種幾乎存在于所有細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，是以p50和p65兩個(gè)亞基以不同的形式組合成的同源或異源二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與抑制蛋白IκB結(jié)合成無活性的復(fù)合物，當(dāng)細(xì)胞受到LPS、炎癥因子等刺激時(shí)，IκB可磷酸化，使其從 NF-κB 脫落，NF-κB 得以活化，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞分化和凋亡等多種反應(yīng)。

由于NF-κB能特異性識(shí)別并結(jié)合目的基因上的κB序列，利用這個(gè)特性，合成包含 κB序列的ds-ODNs并轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞核，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核內(nèi)激活的NF-κB，抑制其活性［5］，這一策略也被稱為 decoy，該策略已經(jīng)在心血管疾病［6］、肺部疾?。?］、腎臟疾?。?］、炎癥性疾?。?］、抗腫瘤［10］的治療研究中取得了令人滿意的結(jié)果。

在本研究中，我們用Western blot法檢測(cè)SW480細(xì)胞中NF-κB p65蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，結(jié)果顯示，與SODN組和LPS組相比，NODN組NF-κB蛋白質(zhì)含量無顯著改變，即 NF-κB decoy不影響 NF-κB的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。但用TransAMTM法檢測(cè)NF-κB活性，結(jié)果卻顯示，NODN組NF-κB p65 DNA結(jié)合活性顯著低于LPS組，即NODN組NF-κB p65 DNA結(jié)合活性被抑制。說明 NF-κB decoy ODNs雖不能阻止NF-κB細(xì)胞核移位，但可以通過結(jié)合占據(jù)其功能區(qū)域阻斷進(jìn)入細(xì)胞核的 NF-κB參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而SODN組和Lipofectamine2000組NF-κB p65 DNA結(jié)合活性不受抑制。

吳禮國等［9］用NF-κB decoy ODNs 研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB decoy ODNs的處理并沒有減少小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)，提示其并沒有阻止激活的NF-κB從胞質(zhì)進(jìn)入胞核。李磊等［2］在對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，NF-κB decoy ODNs抑制了NF-κB的結(jié)合活性，但抑制不了NF-κB蛋白表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。說明NF-κB decoy ODNs通過抑制核移位后NF-κB的活化，阻止其與靶基因κB位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止其靶基因的轉(zhuǎn)錄，這種作用發(fā)生在細(xì)胞因子瀑布的上游，能同時(shí)阻斷多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果表明，NF-κB decoy ODNs在體外明顯抑制LPS干預(yù)后SW480細(xì)胞的NF-κB DNA結(jié)合活性，因此其有望成為結(jié)腸癌、IBD的一種新型的基因治療藥物。

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