黃偉煒，楊 瑩，劉 寧

(1海南省人民醫(yī)院，?？?70311;2黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校)

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有良好的水溶性和抗瘧效果，同時表現(xiàn)出強大的抗腫瘤活性［1］。研究［1，2］發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯具有很強的抗結(jié)腸癌作用，但對于其抗癌機制尚不清楚。我們的前期研究結(jié)果表明，較低濃度(＜15μmol/L)的青蒿琥酯即可抑制體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞增殖、遷移［3］。2010年6月1日～2011年6月30日，我們觀察了青蒿琥酯對人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響，并觀察了經(jīng)青蒿琥酯作用的HCT-8細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素-2(Ang-2)的表達(dá)變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 青蒿琥酯購于桂林南藥股份有限公司(批號H10930195)，用于實驗時先用0.5%的NaHCO3溶解，再用生理鹽水配置成所需濃度。VEGF鼠單抗和Ang-2兔多抗購于Santa Cruz公司。EliViaionTMplus鼠/兔通用試劑盒和DAB顯色試劑盒購于邁新生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞(由中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供)置含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時分組，青蒿琥酯組分別加入不同濃度青蒿琥酯，陽性對照組不加任何藥物;同時設(shè)陰性對照組(為單純RPMI1640培養(yǎng)基)。

1.3 大鼠主動脈環(huán)體外生長實驗 將青蒿琥酯組、陽性對照組細(xì)胞用RPMI1640沖洗3次，放入無血清RPMI1640培養(yǎng)液中孵育4 h;離心收集細(xì)胞后用無血清RPMI1640液稀釋至1×106/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無菌條件下1 200 r/min和12 000 r/min分別離心10 min，獲得條件培養(yǎng)液。取1 mm長大鼠新鮮胸主動脈環(huán)30個，置入由纖維蛋白原、牛凝血酶、無血清培養(yǎng)液MCDB-131等混合制成的凝膠中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 d。分別加入各組條件培養(yǎng)液，與大鼠主動脈環(huán)一起孵育。每日觀察新生血管生長情況，第14天血管生成達(dá)高峰，每組各取6個主動脈環(huán)，計數(shù)新生血管數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長實驗雞胚孵化4 d，在近氣室處開口，暴露接種部位，置孵箱內(nèi)穩(wěn)定24 h后分組并作相應(yīng)處理。①陰性對照組:將浸有RPMI1640、約1 mm×1 mm×1 mm大小的可吸收明膠海綿(無菌)置于雞胚接種部位。②陽性對照組:按照該實驗標(biāo)準(zhǔn)流程，在第6天將浸有100μL HCT-8細(xì)胞懸液的可吸收明膠海綿(無菌)置于雞胚接種部位。③青蒿琥酯組:將部分陰性對照組雞胚額外孵育1 d，分別給予100μL不同濃度青蒿琥酯處理后的HCT-8細(xì)胞懸液于可吸收明膠海綿上。上述三組雞胚用消毒的半透明封口膜封口，置孵箱中孵育，至第12天小心剝離各雞胚絨毛尿囊膜，固定后于400倍光鏡下觀察并拍照，管腔小于8個紅細(xì)胞大小且不帶肌層的小管腔血管為微血管，觀察5個高倍視野，取均值作為每例標(biāo)本的微血管密度。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 VEGF、Ang-2蛋白的檢測 采用 Western blot法。分別收集“1.2”的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，定量后加入等體積2×上樣緩沖液，煮沸。取部分蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗，4℃過夜(β-actin為內(nèi)參照)，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，DAB顯色，IPP光密度分析軟件進(jìn)行蛋白條帶的光密度檢測。用目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，樣本均數(shù)的比較用Dunnett＇s t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對HCT-8細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的影響 大鼠主動脈環(huán)體外生長實驗結(jié)果顯示，陽性對照組于第3天起鏡下可見有新生血管生成，第7～13天新生血管迅速增多，第14天后血管生成速度減慢、生成量逐漸減少;青蒿琥酯組新生血管形成時間明顯滯后，于第7～10天才見有新生血管出現(xiàn)，同時血管萌芽密度明顯降低，呈青蒿琥酯劑量依賴性。至第14天，陽性對照組新生血管數(shù)為(127.5±7.86)條，陰性對照組為(61.17 ±6.13)條，兩組相比P ＜0.01;3、6、12 μmol/L 青蒿琥酯組新生血管數(shù)分別為(55.23 ±3.68)、(32.84 ±4.13)、(12.66 ±2.71)條，與陽性對照組相比，P 均＜0.05;與陰性對照組相比，P＞0.05(3μmol/L青蒿琥酯組)和P＜0.05(6、12 μmol/L 青蒿琥酯組)

雞胚絨毛尿囊膜體內(nèi)血管生長實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組可見有大量新生微血管呈放射狀排列于海綿周圍，血管密度增大、分支明顯增多、管徑增粗。陽性對照組新生血管數(shù)為(63.00±4.62)條，陰性對照組為(39.00 ±3.25)條，兩組相比，P＜0.01。青蒿琥酯組的血管密度、分支減少，管徑變細(xì)，3、6、12μmol/L青蒿琥酯處理組血管數(shù)分別(47.00 ±3.65)、(38.00 ±2.41)、(17.00 ±2.67)條，與陽性對照組相比(血管數(shù)分別減少22.9%、36.24%、74.82%)，P 均 ＜ 0.01;與陰性對照組相比，P＞0.05(3、6μmol/L青蒿琥酯組)和P＜0.05(12μmol/L青蒿琥酯組，血管數(shù)減少56.4%)。

2.2 青蒿琥酯對HCT-8細(xì)胞VEGF、Ang-2表達(dá)的影響 各組HCT-8細(xì)胞VEGF、Ang-2表達(dá)比較見表1。

表1 各組HCT-8細(xì)胞VEGF、Ang-2表達(dá)比較(ˉx±s)

3 討論

目前，手術(shù)切除仍是治療結(jié)腸癌的首選方法，但由于術(shù)后局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，患者5年生存率仍較低。腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤新生血管的形成。研究［4］證實，結(jié)腸癌組織中存在明顯的血管新生現(xiàn)象。結(jié)腸癌組織微血管密度與結(jié)腸癌的臨床分期有關(guān)，是結(jié)腸癌獨立的預(yù)后因素［4，5］。本觀察結(jié)果顯示，陽性對照組HCT-8新生血管明顯多于陰性對照組和青蒿琥酯組，同時還高表達(dá)血管新生調(diào)控因子VEGF和Ang-2，進(jìn)一步提示結(jié)腸癌細(xì)胞具有極強的血管新生促進(jìn)能力。

體外實驗結(jié)果顯示，青蒿琥酯可抑制體外培養(yǎng)的骨髓瘤、白血病、卵巢癌細(xì)胞等誘導(dǎo)的血管新生［6～8］;體內(nèi)實驗亦發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可抑制 Kaposi肉瘤鼠模型中腫瘤組織血管的生長［9］。在本研究中，大鼠主動脈環(huán)體外生長實驗結(jié)果顯示，與陽性對照組相比，青蒿琥酯組主動脈環(huán)上血管萌芽出現(xiàn)時間明顯延遲，密度低，且呈青蒿琥酯濃度依賴性。雞胚尿囊膜體內(nèi)血管生長實驗結(jié)果顯示，與陽性對照組相比，青蒿琥酯組尿囊膜血管分支顯著減少，密度下降。上述體內(nèi)、體外實驗結(jié)果均提示青蒿琥酯具有抗結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力。

血管新生受多種因素的調(diào)控，其中專一作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF和Ang-2相互協(xié)調(diào)，在血管形成過程中起關(guān)鍵作用［10］。VEGF是經(jīng)典血管生成促進(jìn)因子，主要促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖。Ang-2是近年發(fā)現(xiàn)的另一種對血管內(nèi)皮有專一性的促血管新生因子家族成員，其主要作用是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞滲漏，誘使其出芽，與VEGF相互協(xié)調(diào)，促進(jìn)血管新生。已經(jīng)證實 VEGF 和 Ang-2 在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)［4，11，12］。本研究結(jié)果顯示，較低濃度的青蒿琥酯(3μmol/L)即可抑制HCT-8細(xì)胞VEGF和Ang-2的表達(dá)。提示青蒿琥酯對HCT-8細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的抑制效應(yīng)可能與其下調(diào)該細(xì)胞VEGF和Ang-2的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，青蒿琥酯不但可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移，還對其誘導(dǎo)血管新生的能力有抑制作用。青蒿琥酯對結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的抑制效應(yīng)可能與其下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF和Ang-2的表達(dá)有關(guān)。

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