蘇桂源,孫 凱,李國新,余 江
(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院,廣州510515)
微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA,于轉錄后水平調控靶基因表達,其作為一類潛在的癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[1~3]。miRNA-338-3p(miR-338-3p)是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA,其在結直腸癌中的表達情況及其調控靶目標的表達情況尚未見報道。Smoothened(SMO)蛋白是Sonic hedgehog(Shh)信號通路中的一個關鍵跨膜蛋白,具有開關該信號通路的作用;Shh信號通路異常激活可促進腫瘤細胞增殖、遷徙以及新生血管的形成[4,5]。本研究觀察了結直腸癌組織中miR-338-3p及SMO的表達情況,為探討兩者可能的內在調控關系提供實驗依據(jù)。
1.1 臨床資料 2010年9~12月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院收治的結直腸癌患者30例,男16例,女14例;年齡(58.8±11.2)歲。其中結腸癌19例,直腸癌11例。患者接受手術治療時,留取癌組織,同時取距離癌腫5 cm的腸黏膜(癌旁組織)及距離癌腫10 cm以上的腸黏膜(作為正常對照)。全部患者術前未接受放化療。標本采集后用DEPC水處理并快速置液氮中冷凍,-80℃保存。
1.2 引物設計與合成 自miRNA Base數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/)和 Genebank 查找基因序列,用Primer-Express 2.0軟件進行引物設計。miR-338-3p及內參照RNU6B由GeneCopoeia公司設計合成。SMO上游引物為5'-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3',下游引物為 5'-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3',擴增片段長 322 bp;內參照GAPDH上游引物為5'-GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3',下游引物為 5'-CGTTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3',擴增片段長346 bp;上述引物由上海英濰捷基公司合成。
1.3 miR-338-3p的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術。用Trizol抽提標本組織中的總RNA,使用Beckman Coulter DU800核酸蛋白分析儀測定 RNA濃度,RNA的 A260nm∶A280nm≥1.8,經甲醛變性凝膠電泳后取 28S、18S泳道的RNA條帶進行鑒定,實驗所用RNA具備較高的純度及完整性。使用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection試劑盒進行miRNA逆轉錄反應和Q-PCR反應,嚴格按照說明書進行操作,每個標本均作復管PCR反應。用RNU6B作為內參照。樣本中miR-338-3p的ΔCt值 =樣本中 miR-338-3p的 Ct值 -RNU6B的Ct值;因用Real-time Q-PCR來檢測RNA時,不同RNA樣本存在不同的逆轉錄效率,故以正常對照的腸黏膜ΔCt值進行校正,得出ΔΔCT值,ΔΔCt=(CtmiR-338-3p- CtRNU6B)目的樣本- (CtmiR-338-3p-CtRNU6B)校正樣本,各樣本中 miR-338-3p 的含量用 2-ΔΔCt表示。
1.4 SMO mRNA的檢測 采用半定量RT-PCR技術。取提取的總RNA 3μg作為模板合成cDNA,然后進行PCR。取擴增產物5μL行2.0%瓊脂糖凝膠電泳,用Pharmacia Master Image紫外凝膠成像系統(tǒng)進行電泳條帶分析。SMO mRNA相對含量=目的基因條帶積分吸光度值/內參照GAPDH基因條帶積分吸光度值。每個樣本重復檢測3次。
1.5 SMO蛋白的檢測 采用Western blot。稱取標本組織100 mg,置高壓滅菌的研缽上,加液氮研磨成組織漿,加入蛋白提取液1 mL,充分攪勻后超聲破碎5 min,4℃、12 000 g離心10 min,收集裂解物總蛋白;凱基BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取總蛋白50μg,加凝膠上樣緩沖液調整體積,于100℃加熱5 min,使蛋白完全變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并原位電轉印至PVDF膜,該膜經5%脫脂奶粉封閉處理后,與兔抗人SMO多克隆抗體和內參照β-Acion分別孵育。膜漂洗后分別與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的特異性二抗反應,增強化學發(fā)光法(ECL)顯影得到蛋白印記條帶,以Quantity One軟件檢測灰度值。每個樣本重復檢測3次。
1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。組間比較用配對設計兩兩比較t檢驗,相關性分析用Spearman相關分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結直腸癌組織中miR-338-3p的表達量為0.153 7 ±0.126 4,SMO mRNA 相對表達量為 0.371±0.116,SMO 蛋白灰度值為 3.195 ±1.623,癌旁組織分別為 0.901 5 ±0.426 3、0.366 ±0.117、0.733±0.305,兩種組織中的 miR-338-3p、SMO 蛋白表達相比,P均<0.01;miR-338-3p與SMO蛋白的表達呈負相關(r= - 0.877,P < 0.01)。SMO mRNA、SMO蛋白的電泳條帶見圖1、2。
圖1 SMO mRNA在結直腸癌及癌旁組織中的表達注:T1和N1、T2和N2、T3和N3分別為3例患者癌組織和癌旁組織中的SMO mRNA
圖2 SMO蛋白在結直腸癌與癌旁組織中的表達
有學者[6]曾采用液相芯片技術檢測發(fā)現(xiàn),miR-338-3p在肝細胞癌組織中的表達顯著下調。本研究結果顯示,miR-338-3p在結直腸癌組織中的表達水平較癌旁組織顯著下降。提示miR-338-3p基因的表達缺失可能參與了結直腸癌的發(fā)生及演進過程。miR-338-3p定位于染色體17q25.3,而染色體17q23-25位點常是多種惡性腫瘤的突變熱點,且其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠處轉移等惡性生物學行為密切相關[7],此現(xiàn)象亦提示miR-338-3p可能參與了腫瘤侵襲轉移的進程,而這亦與我們前期預實驗中所發(fā)現(xiàn)的miR-338-3p在轉移性結直腸癌中表達水平更低的結果相一致。說明miR-338-3p可能是一種與結直腸癌侵襲轉移密切相關的抑癌基因。
Shh信號轉導通路主要由分泌型信號糖蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白SMO組成的復合物以及下游轉錄因子Gli蛋白等組成[8]。其中SMO蛋白是Shh信號通路中關鍵的信號轉換器,具有調控Shh信號通路開或關的作用,即SMO蛋白能夠將細胞外的Shh信號轉換成細胞內的Gli信號,從而啟動細胞核內特異基因的轉錄,對Shh信號通路具有激活作用。研究[9]證實,Shh信號通路亦參與調控腫瘤細胞的運動、遷移和腫瘤血管形成,在腫瘤侵襲與轉移過程中發(fā)揮重要作用,相應地激活或抑制Shh信號亦可促進或抑制腫瘤轉移。我們通過TargetScan、PicTar、miRanda等生物信息學分析軟件篩選miR-338-3p的可能作用靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-338-3p與SMO mRNA 3'非翻譯區(qū)(UTR)存在互補結合,提示SMO蛋白可能是miR-338-3p在結直腸癌中新的作用靶點,miR-338-3p可能通過調控SMO蛋白表達,進而影響結直腸癌侵襲轉移的生物學行為。
miRNA主要通過切割降解和翻譯抑制兩種機制來調控其靶基因的轉錄后表達。由于絕大部分miRNA不能與其靶基因的轉錄體完全配對,故認為miRNA主要通過翻譯抑制的方式發(fā)揮生物學效應[10~12]。本研究證實,SMO mRNA 在結直腸癌和癌旁組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義,但SMO蛋白卻在結直腸癌組織中表達顯著增高,再結合miR-338-3p表達下降且兩者之間存在明顯的負相關關系這一結果,推測miR-338-3p可能通過不完全互補配對方式與SMO mRNA 3'UTR結合,故僅能抑制SMO mRNA的進一步翻譯,但不能將其根本降解;而結直腸癌組織中由于miR-338-3p表達下調,從而未能于轉錄后水平沉默SMO蛋白表達,導致SMO蛋白表達上調,繼而異常激活Shh信號通路,促進結直腸癌侵襲轉移。
綜上所述,結直腸癌組織中miR-338-3p表達明顯下調,SMO蛋白表達明顯上調,miR-338-3p可能通過轉錄后基因沉默機制使SMO蛋白表達下降,從而抑制結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。此為結直腸癌發(fā)病機制和診斷治療的研究提供了新的思路和實驗基礎。
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