陳永秀綜述，蒙開喜審校

(廣西橫縣人民醫(yī)院檢驗科，廣西 橫縣 530300)

地中海貧血(thalassemias) 是一類以珠蛋白α鏈或β 鏈合成不足或缺失為特征的隱性遺傳性疾病。最常見為α-地中海貧血(α-地貧)和β-地中海貧血(β-地貧)，在我國主要分布在南方，如廣東、廣西、海南、香港有著較高的發(fā)病率[1]。開展地貧檢測是臨床上診斷貧血類型必不可少的項目，進行血紅蛋白電泳及基因檢測可以診斷是否是地貧及地貧的類型。區(qū)分貧血類型有利對臨床貧血的治療，避免過分補充鐵劑造成地貧患者的損害。產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷可避免重型地貧患兒的出生[2]，對優(yōu)生具有重要意義。目前檢測地中海貧血的實驗室方法主要有篩查法和基因診斷法兩種。

1 檢測地中海貧血方法(篩查法)

1.1 血常規(guī)測定 地中海貧血的重要典型特征之一是小細胞，低色素，最重要的血液學(xué)指標(biāo)為MCV<80fl,MCH<27pg，則可能為地中海貧血(或其基因攜帶者)或缺鐵性貧血。利用MCV、MCH 作為地中海貧血的一種初篩手段具有重要的實用價值[3]。

1.2 紅細胞形態(tài)學(xué)檢查 涂片、瑞氏染色，由于貧血輕重不一，紅細胞可出現(xiàn)大小不均、多種異常形態(tài)、嗜堿性點彩紅細胞、靶形紅細胞等。貧血越嚴重，異形性越明顯。

1.3 紅細胞滲透脆性試驗(一管法) 地中海貧血的紅細胞膜存在形態(tài)、生化、代謝異常，故地中海貧血患者的紅細胞脆性降低[4]，在0.36%NaCl 中溶解度降低(脆性降低)。缺鐵性貧血亦呈陽性。近幾年來國內(nèi)外普遍采用MCV和紅細胞透脆性試驗作為地貧診斷的篩查檢測項目[5]。

1.4 不穩(wěn)定血紅蛋白測定

1.4.1 異丙醇試驗 地中海貧血血液中存在不穩(wěn)定血紅蛋白，不穩(wěn)定血紅蛋白在370C的17%異丙醇溶液中在5min 出現(xiàn)沉淀，20min 左右形成絮狀。

1.4.2 熱變性試驗 不穩(wěn)定血紅蛋白在加溫時比正常血紅蛋白更容易發(fā)生沉淀。在500C～600C 時α-地中海貧血的沉淀量偏高。此法敏感性不高，容易受比色影響，而特異性比異丙醇試驗高。

1.4.3 變性血紅蛋白包涵體檢查 將含有不穩(wěn)定血紅蛋白的紅細胞在體外與煌焦油藍等試劑370C 孵育1h 及2h 后便生成大量包涵體。α-地中海貧血HbH 病的紅細胞內(nèi)含有較多包涵體，變性血紅蛋白包涵體是診斷HbH 病的一項簡易、方便的方法，同時對α-地中海貧血1和α-地中海貧血2的診斷也有重要意義。

1.5 血紅蛋白電泳 血紅蛋白電泳是檢測和識別異常血紅蛋白最常用的實驗室方法[6]。

1.5.1 血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳 各種血紅蛋白均帶有電荷，其等電點均在7 以下，故在pH8.5的緩沖液中各種血紅蛋白均帶負電荷，在電場的作用下都向陽極泳動，不同的血紅蛋白，其等電點不同，電泳速度不一，故在電泳圖譜上呈現(xiàn)不同位置區(qū)帶。還可以比較各區(qū)帶染色強度，換算出HbF、HbA2等的含量，對血紅蛋白病的篩查有重要價值。但是，有些異常血紅蛋白總的電荷改變極少或不改變，特別是某些不穩(wěn)定的血紅蛋白及氧親和力增強的異常血紅蛋白，電泳時它們不能和HbA 分離而不被檢出。因而進一步用多種不同的電泳和用不同的支持介質(zhì)、緩沖劑、電泳儀器及各種方法。醋酸纖維薄膜較脆，容易破碎，區(qū)帶顏色容易脫，不易保存。應(yīng)用大樣醋酸纖維薄膜電泳可將各種血紅蛋白區(qū)帶成分分離，洗脫測定各組分的含量。進行區(qū)帶鑒別與含量的測定，對地中海貧血的診斷起到關(guān)鍵的作用。常用醋酸纖維薄膜pH8.5的緩沖液中進行不連續(xù)電泳，將HbA2分離、然后分別剪取HbA2、HbA 區(qū)帶，用蒸餾水浸泡，用比色計比色，計算出HbA2含量。測定HbA2含量對于地貧的診斷有重要意義[7]。有HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶時剪取HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶，測定HbH、Hb Bart’s含量。

1.5.2 珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳 用尿素將血紅蛋白解離成多肽鏈，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的電荷與分子篩效應(yīng)，將各種肽鏈分離，形成不同的區(qū)帶，當(dāng)各種珠蛋白鏈的合量或結(jié)構(gòu)發(fā)生異常時，珠蛋白鏈區(qū)帶出現(xiàn)與正常不同的改變，通過各區(qū)帶含量比例的測定了解各珠蛋白基因的表達，可檢出β0-β+地中海貧血和大部分α-地中海貧血患者。缺點是操作煩瑣，試劑毒性大，結(jié)果不穩(wěn)定，容易引起ζ 珠蛋白鏈假陽性。

1.5.3 高效液相色譜(HPLC) 現(xiàn)已用于定量分析HbA2和HbF。研究表明，采用(HPLC)技術(shù)的陰陽離子交換層析儀進行血紅蛋白自動化分析及抗堿血紅蛋白測定等相比，具有快速簡便、結(jié)果穩(wěn)定的特點。尤其對β-珠蛋白生成障礙性貧血有良好的快速診斷能力[8]。

1.5.4 毛細管區(qū)帶電泳(CE)全自動毛細管區(qū)帶電泳法是充滿緩沖液的石英管中進行電泳技術(shù)。在溶血試劑中進行稀釋的紅細胞樣品會被注射到毛細管的陽極端，在高電壓的作用下進行分離，在陰極端415nm 波長下直接檢測血紅蛋白各組分含量。對HbA2可自動鑒別和定量該區(qū)帶，可完美區(qū)分和聚焦HbA與HbS 之間的HbF，并可對其進行精確測定[9]。

1.5.5 全自動瓊脂糖電泳全自動瓊脂糖電泳是根據(jù)不同Hb 分子所帶電荷不同，在電場中遷移率不同而達到分離Hb 不同成份的目的。經(jīng)染色、脫色、固定，烘干后用掃描儀掃描電泳膠片，對各條區(qū)帶進定量分析?？蓲呙璧贸鯤bA2、HbA、HbF、HbH、Hb Bart’s 及其他異常血紅蛋白含量。其方法簡便，電泳和染色可同時進行，所用時間短，掃描得出較準確的各組分的血紅蛋白含量。電泳瓊脂糖膠片容易保存，區(qū)帶顏色不容易脫，區(qū)帶清淅，根據(jù)HbA2、、HbA、HbF的含量能將地中海貧血初步分為α-地中海貧血和β-地中海貧血，是目前篩查地中海貧血較理想的方法。全自動瓊脂糖電泳系統(tǒng)能準確分離各種區(qū)帶，圖譜可永久保存[10]。缺點是不能進行分型，且得出的HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶有些呈散在的云霧狀，容易引起假陰性。因而有研究建議檢測時應(yīng)注意[11]，當(dāng)HbA2區(qū)帶淡染含量降低，異丙醇試驗陽性時最好做醋酸纖維薄膜電泳報告。

2 基因診斷

基因診斷又稱分子診斷，是通過對受檢者某一特定基因(DNA)或某轉(zhuǎn)錄物(mRNA)進行分析來對遺傳病進行診斷的技術(shù)。我國對地中海貧血的基因診斷多年來先后經(jīng)歷了DNA 點雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)鏈鎖分析、寡核苷酸(ASO)探針雜交和了聚合鏈酶反應(yīng)(PCR)體外基因擴增、芯片技術(shù)等6個發(fā)展階段。特別是PCR 及其相關(guān)發(fā)展技術(shù)，已成為最為普遍的診斷方法。

2.1 限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)鏈鎖分析原理 DNA 限制性內(nèi)切酶可識別并切割DNA 上特定核苷酸序列，得到一定長度的DNA 片段，而堿基的突變可導(dǎo)致酶切位點的丟失或形成，從而改變酶切片段的大小。突變基因在經(jīng)過相應(yīng)限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量與大小都會發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可判斷突變是否存在。缺點是不能直接測出受檢者突變基因的類型，且操作繁瑣。

2.2 探針斑點雜交技術(shù)(ASO) 應(yīng)用引物擴增珠蛋白基因，同時合成與正常序列和突變序列完全互補的寡核苷酸探針。將PCR 擴增產(chǎn)物點在尼龍膜上，分別與標(biāo)記的正常和突變的ASO 探針雜交，不完全互補的探針在一定條件下可完全洗脫，再從放射自顯影觀察雜交結(jié)果。這種檢測方法快速、靈敏，缺點是對DNA的純度和數(shù)量要求較高。目前已廣泛應(yīng)用于β-地中海貧血的基因診斷。

2.3 聚合鏈酶反應(yīng)(PCR) PCR 是利用DNA 聚合酶等在體外的條件下 催化一對引物間的特異DNA 片段合成的基因體外擴增技術(shù)。以PCR為基礎(chǔ)的診斷方法已應(yīng)用于α-地中海貧血的基因診斷[12]。特別是多重PCR，它的特點是在一個PCR 體系內(nèi)包含4 對等位基因的特異引物。根據(jù)每個突變位點特異擴增來判斷結(jié)果。應(yīng)用多重PCR 法可檢測α-珠蛋白基因東南亞缺失(-SEA)、右缺失(-α3.7)和左缺失(-α4.2)。多重PCR可對缺失型α-地中海貧血進行基因分型和類別辨別[13]。利用單管多重PCR可準確、快速檢測出(-SEA、-α3.7、-α4.2)用于α-地中海貧血分子篩查和產(chǎn)前診斷[14]。

2.4 Southern 印跡雜交 鑒別DNA 靶分子的雜交稱為Southern 印跡雜交，是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA 片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上然后用標(biāo)記的DNA 探針檢測待測DNA的一種方法。利用Southern 印跡雜交可以檢測基因缺失。到目前為止，Southern 印跡雜交技術(shù)診斷α-地中海貧血仍然是基因診斷α-地中海貧血的金標(biāo)準。

2.5 缺口PCR 其原理是設(shè)計三對或兩對引物 即在缺失區(qū)域外側(cè)，靠近缺失位點的位置設(shè)計一對引物，另外一個或一對引物在缺失區(qū)域內(nèi)。在缺失區(qū)域內(nèi)的引物能夠在雜合子與正常人中擴增出片段，在缺失純合子中不能擴增，在缺失區(qū)域外側(cè)的一對引物，因為缺失使相距甚遠的兩端DNA 拉近，從而可擴增出特定的DNA 片段，從而檢出純合子患者。有文獻報道用缺口PCR 法成功檢測出三種缺失型地中海貧血[15]。

2.6 反向點雜交法 其原理與傳統(tǒng)的等位基因特異性寡核苷酸探針點雜交的原理基本相同，所不同的是：將膜上固定探針取代固定靶DNA，經(jīng)一次雜交可對未知樣品中多個突變進行檢測，改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測一種突變的方式。具有快速、敏感、操作簡單的特點。是目前國內(nèi)外最常用的技術(shù)，呂燕波[16]報道，應(yīng)用此法可以同時檢測β-珠蛋白基因是否發(fā)生17個點的突變。而且這種方法還可以區(qū)分突變類型的純合子、雜合子、雙重雜合子及正?；?。適用于中國人群常用見突變類型β-地貧基因檢測。反向點雜交技術(shù)也應(yīng)用于診斷非缺失型α-地中海貧血的點突變[17]。

2.7 熒光PCR比普通的PCR 敏感性高出1000倍以上，用不同顏色的熒光素對PCR 擴增產(chǎn)物進行標(biāo)記，在DNA 測序儀上同時檢測出不同顏色、不同片段的PCR 擴增產(chǎn)物，從而分辨正常人、雜合子和純合子。應(yīng)用熒光PCR的基因掃描方法，可檢測廣西地區(qū)最常見的幾種β 珠蛋白基因突變，本法簡單，快速，靈敏度高，樣本DNA 用量少[18]。

2.8 基因芯片 根據(jù)基因芯片上不同位置所出現(xiàn)的熒光位點顏色及強弱的變化來判斷地中海貧血的基因突變類型，與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片的診斷技術(shù)在核酸擴增的基礎(chǔ)上，采用熒光標(biāo)記引物延伸的方法，可提高檢測結(jié)果的敏感性和特異性，由于基因芯片高通量特點，可將α、β 地中海貧血基因診斷在一張芯片上完成。適用于大面積的普查。地貧診斷基因芯片具有簡便、省時等特點[19]。

3 小結(jié)

隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，地中海貧血的實驗室檢測的技術(shù)也隨之提高，篩查與基因診斷的的技術(shù)也越來越成熟。基層醫(yī)院由于條件關(guān)系，開展基因檢測比較困難，因此有必要應(yīng)用多種篩查方法相結(jié)合，以提高地中海貧血診斷的準確性，為地貧基因檢測分型提供依據(jù)。基因分析是最可靠的診斷在中海貧血的方法，但目前基因分析費用昂貴、操作繁鎖、費時、對操作人員要求較高，限制了這方面的普及，因此費用低廉、結(jié)果可靠、使用方便、安全省時的基因診斷技術(shù)是人們盼望的事情。地中海貧血的實驗室診斷技術(shù)還須精益求精，更能準確診斷地中海貧血貧血，減少漏診和誤診，盡力創(chuàng)造出最為適合患者診斷的實驗手段。

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