鄧榮春綜述，施橋發(fā)審校

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學醫(yī)學院免疫教研室，江西 南昌 330006)

視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein，RBP)是體內(nèi)一類將視黃醇(VitA)從肝中轉(zhuǎn)運至靶組織以及實現(xiàn)視黃醇的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運代謝的特異的運載蛋白，在協(xié)助視黃醇儲存、代謝及發(fā)揮生理功能中起著重要的作用[1]。1968年Kanai等首次分離發(fā)現(xiàn)RBP，1971年 Peterson和 Berggard從尿中將其分離，隨后在人、小鼠、大鼠、蠑螈、狒狒及豬、牛、綿羊等中對其進行了廣泛研究?，F(xiàn)在，血清RBP和尿液RBP水平常用作肝臟、腎臟疾病的早期診斷和療效觀察的敏感指標之一，也經(jīng)常作為臨床營養(yǎng)狀況評價的指標，用來特異地診斷早期營養(yǎng)不良[2]。本文主要對RBP的理化特性、臨床檢測方法及臨床應(yīng)用等方面進行綜述。

1 視黃醇結(jié)合蛋白的理化特性和生理功能

1.1 RBP的理化特性 RBP分子是一條由183個氨基酸殘基及少部分糖類組成的多肽鏈，分子量為21000，沉降系數(shù)為 3S，等電點pH 4.4-4.8，半衰期為3～12h。人體內(nèi)RBP有三種形式，即RBP、RBP1和RBP2，RBP的多肽鏈失去C末端的亮氨酸殘基 (C末端-Asn-Leu)，成為182個氨基酸殘基，則為RBP1；失去C末端的亮氨酸-亮氨酸殘基(C-末端-Asn)，成為181個氨基酸殘基，則生成RBP2。正常人體內(nèi)主要是RBP、RBP1兩種形式，而慢性腎功能衰竭病人體內(nèi)以RBP2較多[3]。

1.2 RBP的生理功能 RBP的mRNA存在于肝、腎、肺、脾、腦、心和骨骼肌等許多組織中，以肝中含量最高，廣泛分布于人體血漿、腦脊液、尿液及其他體液中。它的主要功能是將視黃醇從肝臟轉(zhuǎn)運到上皮細胞供組織利用。RBP在肝細胞中合成后，與視黃醇以1:1(mol)比例結(jié)合釋放入血，在血液中，又與前白蛋白(prealbumin，PA)以 1:1(mol)比例形成復(fù)合物，從而防止低分子量的RBP被腎小球濾過[4]。在血液中RBP以復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)運體內(nèi)90%的視黃醇至機體組織，當RBP與細胞表面的RBP受體結(jié)合時，視黃醇進入細胞內(nèi)，復(fù)合物解體，游離的RBP能自由濾過腎小球，其中絕大部分(99.97%)被近端腎小管上皮細胞重吸收并被分解，供組織利用，僅有少量從尿中排出[5]。尿中RBP的排出量取決于腎小管的重吸收功能，當腎小球濾過膜或腎小管功能受損時，尿中RBP可明顯升高。RBP本身具有很好的穩(wěn)定性，在體內(nèi)的含量相對恒定。肝外組織 (如腎臟等)發(fā)現(xiàn)大量的RBP-mRNA，提示肝外組織也可合成RBP。肝外組織合成RBP，可能涉及視黃醇的再利用[3]。

2 視黃醇結(jié)合蛋白檢測方法

測定血/尿中RBP的方法較多，常用的有放射免疫法、免疫電泳、酶聯(lián)免疫吸附和免疫透射比濁法等[6]，其中靈敏度高、實用性強的為放射免疫分析法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，而現(xiàn)在臨床多采用免疫透射比濁法。

2.1 放射免疫分析法 (RIA)放射免疫分析法是以放射性核素標記的抗原與反應(yīng)體系中未標記的抗原競爭特異性抗體為基本原理來測定待檢樣品中抗原的一種分析方法。1985年，Beetham[7]首先建立了放射免疫法檢測RBP，血清樣品需稀釋1/500～1/3600，其線性工作范圍為10～200mg/L。此后，范列英[8]等改進125I標記方法，以氯胺-T法進行碘化標記，Sephadex G-75去除游離碘，收集125I-RBP，提高測試效率，該法放化純度95.4%，標記率81.4%。靈敏度、準確度均良好。批內(nèi)CV為4.64%(n=20)，批間CV為5.74%(n=8)，平均回收率為98.62%，檢測范圍為0～320mg/L。血、尿樣品均不需稀釋即可直接測定。放射免疫分析法測定RBP的靈敏度高，特異性強，精密度好，但由于需用特殊的γ射線計數(shù)儀，有放射污染和危害，常用核素的半衰期短，不易快速、靈活的自動化分析等諸多不足，近年來逐漸被其他優(yōu)秀的標記免疫分析方法所取代。

2.2 免疫電泳(IEP)免疫電泳技術(shù)，是區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散相結(jié)合的一種免疫化學分析技術(shù)。其中非濃縮尿蛋白十二烷基硫酸鈉-瓊脂糖凝膠電泳(SDS-PAGE)是近幾年來發(fā)展起來的比較好的尿蛋白電泳方式，分辨率高，蛋白檢出限為15mg/L，能檢測尿蛋白中所含蛋白成分[9]。主要原理是SDS與尿蛋白結(jié)合成一個帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS分子團，以消除尿中各蛋白質(zhì)分子本身存在的電荷差異，且作為電泳載體的瓊脂糖凝膠具有分子篩的作用，電泳時尿中各種蛋白成份在電場中遷移受瓊脂糖凝膠的分子篩作用，按分子量的大小進行分離，形成不同條帶。常見尿蛋白分子量從小到大排列依次為β2-微球蛋白(分子量12KD)、溶菌酶(分子量14KD)、視黃醇結(jié)合蛋白(分子量21KD)、游離輕鏈 (分子量 25KD)、αl-微球蛋白 (分子量30KD)、白蛋白(分子量 67KD)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(分子量77KD)、免疫球蛋白(分子量 150～850KD)[9，10]，SDSPAGE電泳膜片經(jīng)光密度掃描儀可獲得尿蛋白圖譜，計算后可得出各種蛋白的相對百分含量。該法的優(yōu)點是操作相對簡便，結(jié)果清晰，尿液不需要濃縮，尿蛋白的檢測下限為15mg/L，缺點是操作時間長，不易進行全自動分析。

2.3 酶聯(lián)免疫法 (ELISA)酶聯(lián)免疫法基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面，測定時，將受檢樣品(含待測抗原或抗體)和酶標抗體或抗原按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物，反應(yīng)終止時固相載體上酶標抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復(fù)合物)即與標本中待檢抗體或抗原的量成一定比例，經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì)，加入反應(yīng)底物后，底物即被固相載體上的酶催化為有色產(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中被測物質(zhì)的量。該法的優(yōu)點是操作簡單，重復(fù)性好及靈敏度較高，所用試劑易得，儀器設(shè)備要求不高，所以實用性較強，但操作時間較長。1984年，Lucertini[11]等建立了ELISA檢測RBP。1998年謝鑫友[12]等用聚乙二醇為加速劑建立了RBP的快速酶聯(lián)免疫測定法，具有反應(yīng)時間短，操作簡便，重復(fù)性好及敏感性高等優(yōu)點，可替代進口同類產(chǎn)品。

2.4 免疫比濁法 免疫透射比濁法(transmission turbidimetry)測定RBP的原理是利用抗原(RBP)和特異性抗體(羊抗人RBP抗血清)相結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生混濁，其濁度高低即透光度減少、吸光度增加反映樣品中RBP的濃度，可由標準品所做的劑量-反應(yīng)曲線算出。該試劑盒適用于各種類型的半自動、全自動生化分析儀。王寧[13]對免疫比濁法測定血清視黃醇結(jié)合蛋白方法學評價，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)相關(guān)文件，對該方法進行精密度、線性、準確性等評價及臨床初步應(yīng)用。結(jié)果顯示批內(nèi)CV%＜4.0%，批間 CV%＜5.0%，抗干擾性強，Hb≤4.0g/L、膽紅素小于或等于420μmol/L、三酰甘油小于或等于10mmol/L對測定無影響；與進口試劑對比，Y=1.007 5X+0.0029，γ=0.9995，兩者相關(guān)性良好，試劑開瓶穩(wěn)定性良好。免疫比濁法測定血清視黃醇結(jié)合蛋白，方法簡便、快速、靈敏，結(jié)果準確，可用自動分析儀測試，適合臨床檢驗科應(yīng)用。

這些測定方法中，放射免疫分析法靈敏度高，特異性強，但存在環(huán)保和操作人員自身防護等問題；免疫電泳法操作費時，不能自動化分析；ELISA只能定性或半定量，最便捷的是免疫濁度法，經(jīng)濟實惠，可以在全自動生化分析儀上定量測定，是值得推廣的一種方法。

3 RBP的臨床應(yīng)用

3.1 RBP與腎臟疾病 RBP是一種低分子量的蛋白質(zhì)，血中游離的RBP可自由經(jīng)腎小球濾過，并且絕大部分被近端腎小管上皮細胞重吸收，在局部被分解供組織利用，僅有極少量從尿中排出。因此，正常情況下血清中RBP維持在一穩(wěn)定的范圍內(nèi)(25～70mg/L)，尿中 RBP 的量則甚微(＜0.7mg/L)。

當有腎臟疾病時，由于腎小球濾過率下降，腎小管重吸收障礙，血清和尿液中RBP顯著增高。在糖尿病腎病、高血壓腎病等引起腎小球濾過率(GFR)或腎血流量降低時，RBP的濾過率也相應(yīng)減少，致使血液中RBP蓄積而濃度增高。其他慢性腎病患者尿中出現(xiàn)管狀蛋白尿亦可引起血液中RBP升高，早期比肌酐、尿素氮更敏感，也不受飲食的干擾影響。因此，血清RBP的測定可作為腎小球濾過功能障礙的早期指標[14]。在重金屬中毒、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、腫瘤化療藥物等所致早期近端腎小管損傷或在腎移植急性排斥反應(yīng)早期都可使RBP重吸收障礙，尿液中RBP濃度升高。因此，尿RBP測定是評價近端腎小管的功能障礙的早期標志物[15]。

3.1.1 RBP與糖尿病腎病：糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是引起糖尿病患者致殘致死的重要原因之一。糖尿病腎病起病隱匿，早期缺乏典型臨床表現(xiàn)，尿常規(guī)檢查常呈陰性。近年來國內(nèi)外有大量研究報道[16-21]在糖尿病腎病患者早期就可出現(xiàn)腎小球濾過率的下降和腎小管損害，血清和尿液中RBP含量在診斷早期糖尿病腎病是一個較敏感的指標，且隨著病程的發(fā)展而加重，在反映早期腎損害的指標中優(yōu)于β2微球蛋白和尿微量白蛋白，可作為早期糖尿病腎病的診斷依據(jù)之一。

3.1.2 RBP與高血壓腎?。焊哐獕菏且环N臨床常見病，可引起遍及全身的小動脈硬化病變。高血壓腎小動脈硬化與慢性腎衰竭有明確的因果關(guān)系。高血壓腎損害早期是一個隱匿的過程，此階段已出現(xiàn)腎臟的病理改變，而在臨床上出現(xiàn)蛋白尿時，腎臟已有明顯的病理改變，若按此條件診斷高血壓腎硬化，腎臟的病理改變已不可恢復(fù)。牟曉峰[22]等采用免疫速率散射比濁法和免疫透射比濁法，檢測了122例高血壓病人和110例正常人的尿RBP、尿微量清蛋白(mALB)、尿 β2-微球蛋白(β2-MG)和尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓病人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期組的 RBP、mALB、β2-MG 和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)均明顯高于對照組，并且隨著病程的延長有逐漸增高的趨勢。尿RBP與尿mALB、TRF呈顯著性正相關(guān)，提示高血壓早期階段就存在腎小管功能的損害。尿RBP可作為診斷高血壓早期腎損害的敏感指標之一。

3.1.3 尿RBP對汞作業(yè)者腎臟損害的意義 李曉莉[23]等通過測定85名汞作業(yè)者尿汞、血肌酐(BCr)、尿肌酐(UCr)、血尿素氮(BUN)和尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的水平，發(fā)現(xiàn)汞作業(yè)組的尿汞水平非常顯著地高于對照組(P﹤0.01)，而血肌酐、尿肌酐、血尿素氮水平與對照組比較無統(tǒng)計學意義。這說明汞作業(yè)組盡管有尿汞升高，常規(guī)腎功是正常的，但汞作業(yè)組的RBP水平非常顯著地高于對照組 (P﹤0.01)。研究結(jié)果提示：對于汞作業(yè)者的腎臟損害，RBP較血肌酐、尿肌酐、血尿素氮等傳統(tǒng)指標更為敏感。

3.1.4 RBP與其他腎臟疾病：尿液RBP測定在腎病綜合征、急性腎小球腎炎、過敏性紫癜性腎炎、急性腎衰病人腎功能的評估中也有較高的價值[24]。由于腎臟有很強的儲備代償能力，當傳統(tǒng)的腎病實驗室診斷指標發(fā)生變化時，腎損傷程度已經(jīng)很嚴重。RBP與其他項目聯(lián)合檢查能為腎臟損傷部位及程度提供更準確的鑒別診斷依據(jù)。

3.2 RBP與肝臟疾病 RBP在肝臟內(nèi)合成，當肝臟受各種因素損害后，RBP的合成功能降低，反映在血液中RBP水平的下降，同時，RBP的半衰期較前白蛋白更短，故更能早期敏感地反映肝臟的合成功能與分解代謝的變化。鄭紅[25]等對35例急性病毒性肝炎血清RBP水平與血清膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶活力作相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)急性肝炎病人血清RBP均顯著低于正常人，與血清膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活力均顯著負相關(guān)，提示血清RBP水平能準確、靈敏地反映肝功能變化。同時檢測血清RBP和尿RBP水平，可有助于鑒別肝腎綜合征與肝硬化[26]。肝硬化病人血清RBP水平降低，而尿RBP正常；肝腎綜合征者血清RBP顯著降低、尿RBP顯著高于正常值。

3.3 RBP與營養(yǎng)狀況 RBP半衰期短(3～12h)，生物特異性高，許多臨床疾病都能影響RBP微循環(huán)量，所以血漿RBP水平經(jīng)常作為臨床營養(yǎng)狀況評價的指標，用來特異地診斷早期營養(yǎng)不良[2]。Winkler[27]等分析了正在接受營養(yǎng)療法的營養(yǎng)性疾病患者血漿蛋白變化，發(fā)現(xiàn)血漿RBP的變化早于白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，并與氮平衡的相關(guān)性高于白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，表明血清RBP水平是反映營養(yǎng)性疾病療效的靈敏、特異性指標。

3.4 RBP靈敏反映VitA缺乏癥 VitA的儲存、代謝必須依靠RBP的協(xié)助，否則體內(nèi)VitA的吸收、儲存、轉(zhuǎn)運等環(huán)節(jié)將會改變，引起組織中VitA的分布不均，進而引發(fā)各種疾病，如夜盲癥、結(jié)膜干燥癥，及影響上皮組織、骨組織的生長、分化與繁殖、胚胎發(fā)育等[28]。一旦RBP基因發(fā)生突變，引起氨基酸改變，則不但會引起體內(nèi)RBP含量降至極低，而且誘發(fā)體內(nèi)VitA的含量降低，引起夜盲癥等[29]。血清RBP濃度與VitA含量相關(guān)系數(shù)0.879，當血清中RBP低于正常人一半時，病人出現(xiàn)暗適應(yīng)能力降低。

3.5 RBP與其他疾病[30]乙醇性肌病多有熱能-蛋白質(zhì)營養(yǎng)不足，體內(nèi)RBP、PA水平是影響疾病發(fā)展的重要因素。甲狀腺功能低下的病人，RBP下降。蛛網(wǎng)膜下腔出血病人中，RBP與前白蛋白均顯著下降，在第4d達到最低水平，以后逐漸恢復(fù)，但其下降程度與出血嚴重程度無關(guān)。精神分裂癥、消化系統(tǒng)疾病者，其RBP均低于正常人。當體內(nèi)鋅、鐵缺乏及嚴重感染等疾病能降低RBP的生物合成。

綜上所述，RBP作為一項靈敏的檢測指標已廣泛應(yīng)用于肝臟、腎臟疾病的早期診斷和療效觀察中，對VitA缺乏癥、吸收不良綜合癥等均有較高的診斷意義，值得臨床推廣應(yīng)用。

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