鄒利光 張 松 戚躍勇 廖翠薇 梁開運

乳腺癌是威脅婦女健康最常見的惡性腫瘤，乳腺內(nèi)淋巴管十分豐富，淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑，是決定乳腺癌分期和治療方案選擇的關(guān)鍵因素之一[1]。隨著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子研究的進展，探討淋巴管生成與乳腺癌轉(zhuǎn)移擴散的關(guān)系成為乳腺癌研究新的熱點[2，3]。本文采用二甲基苯蒽灌胃誘發(fā)大鼠乳腺腫瘤，動態(tài)觀察乳腺癌發(fā)生過程中乳腺組織形態(tài)學(xué)改變和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)變化，分析乳腺癌病理分級與腫瘤LVD的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

38～50天齡SPF級Wistar雌性大鼠96只，體重105～142 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。7,12-二甲基苯蒽(7，12- demethylbenz[a] anthracene，DMBA)(美國Sigma公司)，兔抗鼠 podoplanin抗體(AngioBio公司)。配制濃度為10 mg/ml的DMBA麻油溶液，將96只大鼠分批進行灌胃，一次劑量為1 ml，1周后，應(yīng)用同樣的劑量進行第2次灌胃。

1.2 病理觀察

造模后每日觀察大鼠大體情況，手摸6對乳腺部位，記錄有無特殊改變。從第1次灌胃日計時，排除9周前早期死亡的16只大鼠，存活≥10周大鼠80只。從第10周開始，每2周取10只大鼠活殺，至第24周處死所有大鼠。取乳腺腫瘤組織置于10%甲醛液中固定，石蠟包埋。HE染色，確定乳腺腫瘤病理類型及分化程度。乳腺腫瘤組織學(xué)分類參照WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)(2003)[4]，大鼠乳腺癌病理診斷參照Dunn等提出的實驗性大鼠乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。參照微血管密度計數(shù)法，采用“熱點”法計數(shù)淋巴管密度，低倍視野(×100)下尋找熱點，高倍視野(×200)下計數(shù)3個視野最高數(shù)目的微淋巴管，以其平均數(shù)表示。分別計數(shù)腫瘤中央和周邊部位的LVD。取乳腺腫塊組織抗podoplanin抗體免疫組化和免疫熒光染色，觀察抗podoplanin抗體與淋巴管特異性結(jié)合情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)差異采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺腫瘤誘發(fā)結(jié)果

16只大鼠于9周內(nèi)死亡，80只大鼠存活≥10周。第8周開始大鼠乳腺內(nèi)出現(xiàn)小結(jié)節(jié)，大小0.3～0.5 cm，為乳腺普通增生或非典型增生，隨觀察時間延長，乳腺腫塊增多增大，第12周發(fā)展為乳腺癌，到后期乳腺腫塊以乳腺癌為主。80只大鼠中，75只成功誘發(fā)乳腺腫塊，其中乳腺良性增生16只，炎性肉芽腫2只，乳腺癌57只，乳腺癌誘發(fā)成功率為71.25%。57只乳腺癌大鼠共有72個乳腺腫塊，其中43個腫塊分布于第一對乳腺，15個腫塊分布于第二對乳腺，第三、四對乳腺各4個腫塊，第五、六對乳腺各3個腫塊。誘發(fā)腫瘤最小直徑為0.4 cm×0.5 cm，最大直徑為3.1 cm×3.5 cm。同一大鼠乳腺腫瘤數(shù)：1個腫瘤42只，2個腫瘤9只，3個腫瘤4只。所有乳腺腫瘤均為實性腫塊，良性增生腫塊形態(tài)較規(guī)整，邊界清楚；惡性腫瘤形態(tài)不規(guī)整，可見分葉，8個乳腺癌中央有壞死區(qū)。

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察

第10周見有類似于人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞普通增生和非典型增生，隨觀察時間延長，乳腺上皮細(xì)胞非典型增生更加明顯，第12周見有乳腺癌形成。16只乳腺良性增生大鼠中，非典型增生11只，旺熾性增生2只，腺病3只。乳腺癌表現(xiàn)為細(xì)胞核大、異型、深染、排列紊亂。57只乳腺癌大鼠中，浸潤性導(dǎo)管癌34只，浸潤性小葉癌9只，乳頭狀腺癌6只，其他類型腫瘤8只。不同部位腫瘤分化程度有明顯差異，高分化6只，中分化30只，低分化21只。

2.3 腫瘤淋巴管密度

Podoplanin免疫組化染色陽性定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)內(nèi)，可見微淋巴管被染成棕黃色，陽性淋巴管多為單層內(nèi)皮形成，管壁薄，多呈擴張型，管腔大，形狀不規(guī)則，或者呈閉鎖條索狀，有的淋巴管存在管壁的開放，且可觀察到癌栓從淋巴管開放處進入淋巴管內(nèi)的現(xiàn)象，管內(nèi)偶見淋巴細(xì)胞，也可見幾個內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞簇，甚至單個內(nèi)皮細(xì)胞。非典型增生可見個別新生淋巴管和少量較大、較成熟淋巴管，旺熾性增生與腺病未見新生淋巴管，16只乳腺增生性疾病大鼠LVD平均值為(1.52±0.23)個/高倍視野。乳腺癌棕黃色微淋巴管“熱點”區(qū)，多位于腫瘤邊緣部位和癌巢周圍的間質(zhì)中，邊緣區(qū)LVD明顯高于中央?yún)^(qū)。乳腺癌LVD隨腫瘤分化程度的降低而升高，高分化、中分化和低分化乳腺癌LVD分別為(4.43±0.68)、(5.83±1.03)和(9.48±0.93)個/高倍視野，平均值為(6.93±0.84)個/高倍視野。乳腺癌LVD顯著高于乳腺增生性疾病(F=14.03，P<0.01)，低分化乳腺癌LVD顯著高于中、高分化乳腺癌(F=38.25，P<0.001)。不同組織學(xué)類型乳腺癌LVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.35，P>0.05)。

3 討論

大鼠乳腺癌模型的建立有誘發(fā)性、種植性和自發(fā)性3種類型，以DMBA誘導(dǎo)大鼠乳腺癌屬于誘發(fā)性模型，是較為成熟的乳腺癌動物模型，廣泛用于腫瘤的病理形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、影像診斷和藥物治療研究[6,7]。淋巴管在惡性腫瘤的生物學(xué)中扮演著重要的角色，腫瘤生長最初是通過簡單的擴散方式獲得所需營養(yǎng)的，淋巴管呈網(wǎng)狀參與血流氧氣和淋巴成分的擴散，維持腫瘤生長。相對于血管而言，淋巴管不僅營養(yǎng)原發(fā)腫瘤，而且也有利于轉(zhuǎn)移瘤的生長和再轉(zhuǎn)移[4～7]。淋巴管的管腔比較粗，管壁較薄、流速緩慢，與組織液的組成基本相同，因此更有利于腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移擴散。另外，淋巴管參與腫瘤新生血管的形成，也會間接促進腫瘤生長。研究表明，腫瘤周邊與腫瘤內(nèi)部淋巴管的功能存在顯著差異，腫瘤內(nèi)部淋巴管因擠壓而呈條索狀甚或閉塞狀，淋巴管功能較低；而腫瘤周圍及瘤旁的淋巴管則呈擴張狀態(tài)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接由復(fù)雜型向簡單型過渡，大量連接開放形成寬的內(nèi)皮細(xì)胞間隙通道[8]。腫瘤周邊部分淋巴管密度較大，淋巴管功能較明顯。目前認(rèn)為，無論腫瘤內(nèi)部還是腫瘤周圍淋巴管，均與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9,10]。

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多淋巴管標(biāo)記物可用于識別淋巴管，目前認(rèn)為比較好、應(yīng)用最多的淋巴管標(biāo)記物主要有下列3種：VEGFR-3、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)以及podoplanin。VEGFR-3也稱FLT4，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮特異性分子標(biāo)記物，曾經(jīng)認(rèn)為VEGFR-3是1個淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物，最近研究發(fā)現(xiàn)，它在正常組織的某些小血管和一些病理狀態(tài)下新生的血管中有表達(dá)，在血管母細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等一些缺乏淋巴管的腫瘤中也有表達(dá)[8,9]。LYVE-1與透明質(zhì)酸在淋巴管腔表面共同表達(dá)，過去曾認(rèn)為LYVE-1是特異性最強的淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物，但近來研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟和脾臟的血竇內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中都有表達(dá)[10]。Podoplanin是1種細(xì)胞膜黏蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于腎小球足突細(xì)胞，為淋巴管生成所必須，且能促進內(nèi)皮細(xì)胞黏附、移行和淋巴管生成，podoplanin主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，在淋巴管瘤和具有淋巴分化的血管肉瘤中也有表達(dá)[11]，主要是表達(dá)于小的淋巴管，而在血管內(nèi)皮中不表達(dá)。上述3種淋巴管標(biāo)記物中，podoplanin在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)特異性強，且只表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，適用于區(qū)別淋巴管和血管。

LVD即單位面積中毛細(xì)淋巴管及淋巴管的數(shù)目，LVD計數(shù)成為目前公認(rèn)的量化評價腫瘤血管生成活躍狀況的指標(biāo)，它可以反映腫瘤血管生成情況，并與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，評價LVD對區(qū)分腫瘤良惡性和分級、判斷腫瘤預(yù)后有重要的價值[2,8]。我們研究發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺腫瘤組織分化程度的降低，LVD逐漸升高，乳腺癌LVD顯著高于乳腺增生性疾病。不同組織學(xué)類型乳腺癌間LVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不同分化程度腫瘤間其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，低分化乳腺癌LVD顯著高于高分化和中分化乳腺癌。乳腺癌不同部位分化程度可存在顯著差異，podoplanin免疫組化染色“熱點”區(qū)多位于腫瘤邊緣部分，腫瘤周邊部分生長活躍，腫瘤淋巴管生成明顯，LVD較中央部高。

總之，DMBA灌胃誘發(fā)大鼠乳腺癌是較為成熟的乳腺癌動物模型，Wistar雌性大鼠對藥物耐受性較好，乳腺腫瘤誘發(fā)成功率較高。乳腺癌淋巴管豐富，腫瘤淋巴管生成是其生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，隨著腫瘤惡性程度的增高，在大量促淋巴管生成因子的作用下，出現(xiàn)了大量腫瘤新生淋巴管，腫瘤新生淋巴管導(dǎo)致LVD增高，LVD與腫瘤病理分級存在明顯的相關(guān)性。

[1] Khosravi Shahi P，Soria Lovelle A，Pérez Manga G.Tumoral angiogenesis and breast cancer 〔J〕.Clin Transl Oncol，2009，11(3):138.

[2] Achen MG，McColl BK，Stacker SA.Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis〔J〕.Cancer Cell，2005，7(2):121.

[3] 李光明，段百蕓.乳腺癌淋巴管密度的臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(3)：265.

[4] Tavassoli FA，Devilee P.WHO classification of tumours.Pathology & genetics，tumours of the breast and female genital organs 〔M〕.Lyon:IARC Press，2003:10.

[5] 高 進.腫瘤學(xué)基礎(chǔ)及實驗〔M〕.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1992:25.

[6] 李靜蔚，宋愛莉，張敬濤，等.DMBA誘導(dǎo)大鼠乳腺癌癌前病變的組織病理學(xué)研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)，2008，3(26):505.

[7] 張 輝，鄒利光，逄 鑫，等.大鼠乳腺癌CT灌注成像與腫瘤病理分級和微血管密度相關(guān)性研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，32(11)：1131.

[8] Nakamura Y，Yasuoka H，Tsujimoto M，et al.Lymph vessel density correlates with nodal status，VEGF-C expression，and prognosis in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2005，91(2):125.

[9] Le Bourhis X，Romon R，Hondermarck H.Role of endothelial progenitor cells in breast cancer angiogenesis:from fundamental research to clinical ramifications 〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2010，120(1):17.

[10] Schledzewski K，F(xiàn)alkowski M，Moldenhauer G，et al.Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1(+)，F(xiàn)4/80(+)，CD11b(+) macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro:implications for the assessment of lymphangiogenesis〔J〕.J Pathol，2006，209(1):67.

[11] Wicki A ，Christofori G.The potential role of podoplanin in tumor invasion〔J〕.Br J Cancer，2007，96(1):1.