胡婷婷 胡維博綜述 史 健審校

目前腫瘤標(biāo)志物的檢驗(yàn)技術(shù)有三大類：生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)方法。免疫法中放射免疫測(cè)定(RIA)，酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)和免疫熒光測(cè)定(IFA)在臨床中最常用，近年來(lái)雙向電泳(2-DE)、PCR、生物芯片、FISH、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜( SELDI-TOF-MS)等各項(xiàng)新的技術(shù)迅速發(fā)展。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有敏感性及特異性高、器官特異性好、半衰期短等特點(diǎn)，而檢測(cè)方法應(yīng)精密程度、準(zhǔn)確性高，易操作，價(jià)格低廉[1]。本文將對(duì)蛋白組學(xué)技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 蛋白組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物研究中的意義

應(yīng)用雙向電泳聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)，蛋白組學(xué)規(guī)?；貙ふ叶鄠€(gè)與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群，并對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析，從整體網(wǎng)絡(luò)水平了解細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，提示腫瘤發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腫瘤早期篩選檢測(cè)和治療的標(biāo)志物，必將更科學(xué)地指導(dǎo)分子診斷、基因治療，為攻克惡性腫瘤提供更有利的技術(shù)支撐。

2 目前蛋白組學(xué)在惡性腫瘤研究中的應(yīng)用情況

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，蛋白譜必然會(huì)發(fā)生一系列變化。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)主要是通過(guò)尋找腫瘤組織或細(xì)胞系、血漿與正常樣品之間的差異蛋白，初步篩選出與腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)，并后續(xù)應(yīng)用免疫組化、Western、基因轉(zhuǎn)染后確定其表達(dá)的差異，通過(guò)PCR等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并在早期診斷、細(xì)胞凋亡及耐藥性、 轉(zhuǎn)移機(jī)制、監(jiān)測(cè)療效和預(yù)后方面進(jìn)行廣泛而深入地研究，我們將著重介紹其在腫瘤細(xì)胞株中的研究情況。

2.1 在惡性腫瘤早期診斷中的應(yīng)用

病理診斷是惡性腫瘤診斷的重要依據(jù)，但惡性腫瘤依靠影像學(xué)及病理診斷時(shí)多數(shù)已到晚期，目前臨床上多通過(guò)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)來(lái)對(duì)早期惡性腫瘤進(jìn)行普查、鑒別良惡性疾病。在早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤方面，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)擁有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。很多有效的診斷標(biāo)志物存在于蛋白質(zhì)譜(包括差異表達(dá)譜、修飾譜)中，并能有效地指導(dǎo)治療，因此蛋白組學(xué)對(duì)于發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤各個(gè)病種特異性標(biāo)志蛋白，為疾病的早期診斷、個(gè)體化治療提供更好的技術(shù)平臺(tái)[2,3]。

在乳腺癌的研究中，Belluco等[4]已建立起早期患者診斷的蛋白圖譜。Li等[5]通過(guò)對(duì)比乳腺癌及乳腺良性疾病患者的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BC1、BC2、BC3在區(qū)分良惡性乳腺疾病方面具有特異性，并在后續(xù)的試驗(yàn)中證實(shí)，BC2、BC3分別為補(bǔ)體C3a及其片段。Alexander等[6]發(fā)現(xiàn)巨囊性病液狀蛋白(GCDFP-15)、載脂蛋白D(apoD)和α1-酸性糖蛋白(AAG)在乳腺癌患者中呈正調(diào)節(jié)，且與良性乳腺疾病相比，乳腺癌患者的GCDFP-15水平顯著下降，AAG 水平升高，而apoD 則沒(méi)有顯著差異。

王平等鑒定出了包括ATP合成酶、組織蛋白酶、熱休克蛋白60、氯離子通道蛋白、乙二醛酶、異質(zhì)核核糖蛋白A、異質(zhì)核核糖蛋白AZ/BI和KH型剪切調(diào)控蛋白等22種與胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)。

宋大平等[7]通過(guò)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白提取法，對(duì)比HPV陽(yáng)性的宮頸永生化細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)8個(gè)可能參與癌前病變向癌轉(zhuǎn)化的差異蛋白，其中3個(gè)在宮頸癌細(xì)胞株中上調(diào)，1 個(gè)明顯下調(diào)，2個(gè)缺失,另外 2個(gè)在永生化細(xì)胞株缺失，遺憾的是未行差異蛋白的驗(yàn)證。

賈小芳等[8]在應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)，研究人鼻咽癌細(xì)胞系(HNE1和CNE1)與永生化的鼻咽上皮細(xì)胞系時(shí)鑒定出33個(gè)蛋白質(zhì)，其中15個(gè)在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)，18個(gè)下調(diào)，并通過(guò)免疫印跡證實(shí)與細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤的轉(zhuǎn)移等相關(guān)。

2.2 在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制中的應(yīng)用

眾所周知，腫瘤的侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特性，是腫瘤患者死亡的主要原因。研究惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，并適當(dāng)干預(yù)，甚至達(dá)到逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移，對(duì)改善預(yù)后具有重要意義。

臨床前期研究證明，Hsp27是涉及細(xì)胞骨架的穩(wěn)定,耐藥性的產(chǎn)生,細(xì)胞凋亡等的1種重要蛋白，其在乳腺癌患者中過(guò)表達(dá)能增加乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。陳棟等[9]以Hsp27高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為親本，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別導(dǎo)入靶向shRNA敲減載體和對(duì)照空載體，分別構(gòu)建成穩(wěn)定的細(xì)胞系即對(duì)照細(xì)胞株( Hsp27-KD-NC 細(xì)胞株) 和Hsp27敲減細(xì)胞株( Hsp27-KD 細(xì)胞株)，進(jìn)行免疫印記鑒定Hsp27的表達(dá)量，然后應(yīng)用雙向凝膠電泳及MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出7個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中共有4個(gè)蛋白點(diǎn)被定性，包含了3種蛋白質(zhì)，其中2個(gè)被鑒定的是Hsp27,另外2個(gè)點(diǎn)分別為OVCA2(其在Hsp27-KD-3B2細(xì)胞株表達(dá)增高)和PYRG2(其在Hsp27-KD-3B2細(xì)胞株表達(dá)降低),這2種蛋白首次被證實(shí)其表達(dá)受 Hsp27的影響。

朱文等[10]比較了人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981和人低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NL9980，有15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在L9981中出現(xiàn),有27個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在NL9980中出現(xiàn)。

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，nm23-H1基因作為1種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其缺失常伴有侵襲相關(guān)分子如E-cadherin，integrin，selectin，VEGF等異常表達(dá)，導(dǎo)致肺癌的高轉(zhuǎn)移性和預(yù)后差。鄧幼林等[11]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染抑癌基因nm23-H1后，原代人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中6個(gè)蛋白缺失，17個(gè)新的蛋白表達(dá)，5個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)。這種變化與之前周清華等[12]發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(L9981 nm23-H1)中β-catenin、E-cadherin、TIMP-1、CD44S 基因mRNA和蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)，而MMP-2、MMP-9、CD44V6、VEGF、E-seletion基因mRNA和蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下調(diào)可能有相關(guān)性。

馮燕國(guó)等[13]驗(yàn)證了在小細(xì)胞肺癌中存在膜聯(lián)蛋白A1 ( Annexins A1)，可能引起細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng)以及細(xì)胞間黏附能力減弱,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而劉迎福等[14]則進(jìn)一步在肺腺癌中驗(yàn)證annexin A1，annexin A2，annexin A3，B23和S100A9等蛋白與轉(zhuǎn)移相關(guān)。

李群等[15]通過(guò)比較人高低轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株，鑒定出11種蛋白質(zhì)，其中9種僅在低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株中表達(dá)，另外2種僅在高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株中表達(dá)，涉及到的蛋白種類可分為結(jié)合蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及具有磷脂酶C活性的蛋白、具有運(yùn)載體活性的蛋白，尤其推測(cè)其中名為78000 glucose-regulated protein precursor的蛋白與前列腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

孫成榮等研究高低淋巴道轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株，鑒定出168種可能與淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白，涉及代謝及信號(hào)傳導(dǎo)通路等因素。

在鼻咽癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物研究中，通過(guò)研究高低轉(zhuǎn)移性鼻咽癌細(xì)胞系的差異蛋白，陳麗霞等[16]發(fā)現(xiàn)了6種可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白：丙酮酸激酶、β肌動(dòng)蛋白、20s蛋白酶體、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶β-6亞基和血小板活化因子乙酰水解酶，并應(yīng)用免疫組化技術(shù)驗(yàn)證，丙酮酸激酶在高分化鼻咽癌細(xì)胞株中明顯高于在低分化細(xì)胞株中。

2.3 在腫瘤細(xì)胞耐藥性機(jī)制研究方面

研究資料表明，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致化療失敗，是造成腫瘤患者侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，死亡率升高的重要因素。既往對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的研究大多是從某個(gè)或某幾個(gè)基因出發(fā)的，且大多集中于DNA、RNA的水平；然而有研究者指出，基因的mRNA表達(dá)水平與翻譯后蛋白質(zhì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性為0.4～0.5，而蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)解決了經(jīng)蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾以及它們的亞細(xì)胞分布情況等問(wèn)題，從而使得在蛋白質(zhì)整體水平上來(lái)揭示腫瘤多藥耐藥的詳細(xì)分子機(jī)制成為可能。

紫杉醇(Taxol，TAX)作為治療婦科惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌的重要化療藥物，張正華等[17]以MCF-7及其紫杉醇耐藥株MCF-7/Taxol細(xì)胞株為靶細(xì)胞，應(yīng)用親和免疫磁珠層析法獲得紫杉醇的結(jié)合蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳、LC-MS/MS分析、Western blot驗(yàn)證差異條帶中有HSP90、Dermcidin Precursor、Actinin，可能為抗腫瘤藥物的研究尋找新的蛋白靶點(diǎn)、發(fā)現(xiàn)新的腫瘤耐藥機(jī)制。張永亮等篩選出初步定性的蛋白：1，6-二磷酸酶、膜聯(lián)蛋白A2、β-促性腺激素和Ras相關(guān)核蛋白，分別涉及腫瘤轉(zhuǎn)移、能量代謝、細(xì)胞增殖等相關(guān)環(huán)節(jié)。

Smith等[18]通過(guò)對(duì)比 MCF-7乳腺癌細(xì)胞組和順鉑耐藥組，應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在順鉑耐藥組，細(xì)胞角蛋白17、熱休克蛋白、核糖體蛋白等9種蛋白低表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶9、β1蛋白酶體等6 種蛋白高表達(dá)，這些生物學(xué)標(biāo)記物有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

在肺癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究中，有學(xué)者驗(yàn)證出肺腺癌對(duì)順鉑耐藥性的產(chǎn)生與Heat shock protein beta27，ArmexinA2，Cofilin-1，Histone-H4，Triosephosphate isomerase，Peroxinredoxin-4，Vimentin，Proteasome subunit alphatype6，fatty acid-binding proteins，Elongation factor-1等蛋白密切相關(guān)。孫強(qiáng)玲等[19]通過(guò)熒光差異凝膠電泳，研究紫杉醇耐藥及敏感細(xì)胞株，鑒定出了涉及代謝酶類、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶類、黏附分子、細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等19種蛋白。

有學(xué)者在卵巢癌細(xì)胞株順鉑耐藥性的研究方面，提出了14-3-3σ,14-3-3ζ和hNASP，并應(yīng)用Western blot獲得了前者免疫印記圖譜，后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。周莉等[20]研究掌葉半夏總蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響，構(gòu)建了清晰、重復(fù)性好的蛋白圖譜，并分析出550個(gè)差異蛋白點(diǎn)，為研究中藥抗癌提供了新的思路。

甲氨蝶呤為治療絨癌的首選化療藥物，馬海鷗等[21]建立了人絨癌耐藥細(xì)胞株JAR /MTX蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳圖譜，并分析鑒定出1種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白：埃茲蛋白(ezrin)，并推測(cè)此種蛋白過(guò)量表達(dá)可能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。

田浪等[22]對(duì)阿霉素耐藥的肝癌細(xì)胞株HepG2研究，發(fā)現(xiàn)了45個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中在HepG2/ADM中有7個(gè)特異性表達(dá)，25個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)，在HepG2細(xì)胞株中有4個(gè)蛋白點(diǎn)特異性表達(dá)。

2.4 在惡性腫瘤的預(yù)后方面

在食管癌的前期研究中，F(xiàn)erdous等[23]發(fā)現(xiàn)了β-原肌球蛋白(TMβ)、熱休克蛋白70(HSP70)、鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅰ(annexin Ⅰ)、鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)和肌球蛋白一些亞型的表達(dá)失調(diào)可以作為多種消化系統(tǒng)腫瘤的分子標(biāo)志物。其后Norihisa等[24]發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶-3(TGM-3)與患者生存率正相關(guān)，并應(yīng)用免疫組化進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.5 在細(xì)胞周期及其它方面

從細(xì)胞周期的角度研究增殖活性與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展是近年研究的熱點(diǎn)。正常細(xì)胞癌變是細(xì)胞過(guò)度增殖、凋亡減少與分化受阻的結(jié)果。前期研究已構(gòu)建了清晰、重復(fù)性好的肝癌細(xì)胞株HepG2在G1期的蛋白圖譜。前期研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)卵巢癌中的候選的腫瘤抑制因子OVCA1和OVCA2，可能作為1種具有重要生理作用的旁分泌型的激素，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。而PYRG2編碼CTP合成酶2，是CTP合成中的限速酶，在許多生長(zhǎng)旺盛的癌細(xì)胞中，這些酶的活性是升高的，因此近年來(lái)CTP合成酶是許多癌癥治療的1個(gè)靶點(diǎn)，遺憾的是尚未有HSP27影響CTP-2合成機(jī)制的研究。

此外，前列腺癌治療的失敗主要是因?yàn)橛杉に匾蕾嚻诎l(fā)展為非依賴期，進(jìn)而發(fā)展為激素難治期，導(dǎo)致內(nèi)分泌治療無(wú)效。王軒久等[25]對(duì)這一轉(zhuǎn)化的機(jī)制進(jìn)行了蛋白組學(xué)的研究，鑒定出41個(gè)3倍差異點(diǎn)及對(duì)應(yīng)著3種蛋白質(zhì)的10個(gè)完全差異點(diǎn)，完全差異點(diǎn)中有1個(gè)已知蛋白質(zhì)是KIAA1283蛋白質(zhì),具有載脂蛋白功能；另外首次發(fā)現(xiàn)了2個(gè)未命名蛋白，有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3 蛋白組學(xué)技術(shù)與其它檢測(cè)方法的共性與區(qū)別

腫瘤標(biāo)志物在檢測(cè)水平上分為血清、細(xì)胞、分子與遺傳標(biāo)志物?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法都存在靈敏度差的問(wèn)題，多數(shù)都是在發(fā)生某些癥狀和體征后才發(fā)現(xiàn)，難以早期發(fā)現(xiàn)某些腫瘤標(biāo)志物異常，或是難以進(jìn)行高通量的檢測(cè)、或因檢測(cè)方法價(jià)格昂貴難以廣泛用于臨床，導(dǎo)致患者明確診斷時(shí)多屬晚期，預(yù)后差。

蛋白組學(xué)區(qū)別于其它檢測(cè)方法，在于其摒棄其它檢測(cè)方法每次僅可檢驗(yàn)單一腫瘤標(biāo)志物的局限性；且其它方法針對(duì)部分與腫瘤相關(guān)的抗原進(jìn)行檢測(cè)，往往敏感度和特異性差，且具有假陽(yáng)性、假陰性。多變量分析的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用被認(rèn)為在臨床應(yīng)用中更有意義。

蛋白組學(xué)相對(duì)比其它免疫學(xué)檢測(cè)方法而言，是1種新的高通量的技術(shù)手段，具有上樣量少，可檢出微量蛋白，敏感度、特異性更高的特點(diǎn)，能動(dòng)態(tài)、整體、定量的觀察腫瘤發(fā)生的過(guò)程，通過(guò)與正常細(xì)胞、組織等相對(duì)比，得出疾病相關(guān)特異性蛋白質(zhì)，這對(duì)惡性腫瘤的診斷、治療的指導(dǎo)更有針對(duì)性、靶向性、個(gè)體化。

總之，目前蛋白質(zhì)組學(xué)在篩選腫瘤標(biāo)志物方面占有重要地位，特別是初步篩選腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及耐藥相關(guān)蛋白，為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，準(zhǔn)確選擇有效藥物提供新的思路；而亞細(xì)胞器的分離及蛋白純化技術(shù)的大力支撐，使取材更加具有針對(duì)性；再加上基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、免疫印記、免疫組化、聚合酶鏈反應(yīng)等其它科研方法，必將是人類解釋腫瘤規(guī)律，從而攻克腫瘤的新希望。但蛋白組學(xué)技術(shù)具有價(jià)格昂貴、樣品的分離和提純技術(shù)要求高、對(duì)操作人員技術(shù)水平的要求、受限于圖像分析方法等特點(diǎn)，在廣泛臨床應(yīng)用中還存在很多問(wèn)題，仍有待于進(jìn)一步解決。

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