方立慶 綜述 張振華 李旭 審校

HBV感染嚴重危及人類的健康。據(jù)統(tǒng)計全球范圍內(nèi)大約有3.5億HBV慢性感染者[1]，其預后不良，易反復發(fā)作，可發(fā)展為肝硬化和原發(fā)性肝癌。核苷（酸）類藥物問世已有11年，在這段時間內(nèi)，大大提升了對慢性乙型肝炎（CHB）患者的臨床管理。但抗HBV藥物的耐藥已成為制約乙肝抗病毒治療的最重要問題之一。阿德福韋酯（ADV）是嘌呤類核苷類似物，2002年獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準上市，2005年國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準在我國應用于臨床。ADV能有效抑制病毒的復制，但隨著時間的延長，對其耐藥的變異株被選擇出來，且漸成為優(yōu)勢毒株。本文就ADV抗HBV治療的耐藥現(xiàn)狀及耐藥突變的基礎(chǔ)、ADV耐藥的檢測及預防方法、ADV耐藥后的挽救治療策略等方面做簡要綜述。

一、ADV抗HBV的耐藥現(xiàn)狀及其耐藥突變的基礎(chǔ)

（一）耐藥現(xiàn)狀 ADV耐藥率較低，ADV治療1～5年的累積耐藥相關(guān)變異發(fā)生率分別為0%、3%、11%、18%、29%，因耐藥出現(xiàn)病毒學與生化學突破的概率在1～5年時分別為0%、2%、6%、10%、11%、l2%[2]。長期使用ADV的患者可發(fā)生rtA181V/T和（或）rtN236T變異，導致對ADV耐藥[3]。這是目前已證實的與阿德福韋耐藥相關(guān)的主要變異。其他變異還有 rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S等。原發(fā)性 ADV耐藥（rtA181T、rtI233V）也有報道[4]。Schildgen等[5]報道了3例慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)罕見的HBV聚合酶RT區(qū)變異rtI233V。對拉米夫定（LAM）耐藥患者，加用或換用ADV，出現(xiàn)ADV耐藥的發(fā)生率顯著高于ADV初治患者[6]。ADV治療包括LAM耐藥病例在內(nèi)的CHB患者，1年耐藥發(fā)生率升高至5%，2年發(fā)生率為20%[7]。

邵幼林[8]等對28例初始LAM治療的CHB患者，其中男25 例，女 3 例，年齡 18～60（平均 36.67±10.54）歲，出現(xiàn) LAM耐藥后換用ADV單藥序貫治療，發(fā)生ADV再耐藥患者HBV變異株動態(tài)變化存在5種形式：（1）隨HBV DNA逐漸下降，LAM耐藥株比例減少并發(fā)生完全病毒學應答：隨療程的延長，HBV DNA突破，ADV耐藥變異出現(xiàn)（8例）；（2）換用ADV治療后不充分病毒學應答，在LAM耐藥株的基礎(chǔ)上出現(xiàn)ADV耐藥變異，即對LAM和ADV的多重耐藥變異株（3例）；（3）換用ADV治療后不充分病毒學應答，LAM耐藥株依然存在（10例）；（4）換用ADV治療后不充分病毒學應答，LAM耐藥株消失后成為野毒株（4例）；（5）LAM和ADV治療過程中病毒學均不充分應答，但無耐藥變異（3例）。

（二）耐藥產(chǎn)生基礎(chǔ) HBV聚合酶缺乏3’-5’外切酶校對功能，錯配發(fā)生率較高，因此HBV比其他DNA病毒更容易發(fā)生變異。在HBV慢性感染者體內(nèi)存在不同準種（quasi-specie）[9]，一個準種即一個突變株，所以HBV在復制過程中具有較高的自然變異率，并且每24h就可產(chǎn)生3.2×1010含有單一位點突變的HBV DNA[10]。如果HBV基因突變恰好位于HBV DNA聚合酶（P）的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，就有可能產(chǎn)生耐藥。

另外，HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）是HBV基因組復制中間體mRNA和前基因組RNA的合成模板，是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵[11]。cccDNA不僅是轉(zhuǎn)錄各種病毒RNA模板，同時也是HBV病毒前基因組RNA的復制模板，編碼多功能聚合酶、核心蛋白質(zhì)及X和S蛋白[12]。目前尚無特效藥物作用于cccDNA，且一些變異株也可能以cccDNA形式存在，這使得耐藥菌株可持續(xù)存在。所以，HBV DNA的復制率高、突變率高和cccDNA難以清除是HBV容易出現(xiàn)耐藥的主要因素。

由于HBV本身的復制特點，對抗病毒藥物耐藥是不可避免的。與耐藥有關(guān)的因素除了上述的病毒因素外還主要包括宿主因素和藥物因素。宿主因素：治療前患者的HBV DNA水平、抗病毒治療不規(guī)則以及抗病毒藥物選擇不合理、患者的依從性差等。藥物因素：藥物的空間結(jié)構(gòu)、基因屏障和藥代動力學屏障等。ADV與自然底物脫氧胞苷三磷酸（dCTP）存在微小差異，而LAM與dCTP存在顯著差異因此ADV耐藥發(fā)生率明顯低于LAM。

ADV和HBV野生型毒株作用時，與HBV-RT區(qū)有兩個氫鍵緊密結(jié)合：一個位于RT區(qū)236位天冬氨酸的末端氫原子和ADV的末端磷酸根的氧原子之間，另外一個位于236位天冬氨酸的羰基和85位絲氨酸的羥基之間。當發(fā)生rtN236T變異時，這兩個氫鍵會丟失，同時伴隨著靜電相互作用的顯著減少，而此時脫氧三磷酸腺苷（dNTP）與DNA聚合酶的親和力下降卻不明顯，HBV DNA仍可繼續(xù)大量合成[13]。

目前耐藥病毒因素的研究已取得一定的成效，宿主因素、基因屏障和藥代動力學屏障目前研究處于初級階段，HBV對阿德福韋耐藥的分子基礎(chǔ)研究甚少，均有待進一步研究深入。

二、ADV耐藥的檢測及預防方法

（一）ADV耐藥的檢測方法盡管有多種方法[14]（限制性片段長度多態(tài)性分析法、DNA芯片法、焦磷酸測序法、克隆測序法、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜測定法等）可以用來監(jiān)測ADV耐藥突變，但臨床上應用最多的還是PCR產(chǎn)物直接測序法（direct or population sequencing）和反向線性雜交法（INNO LiPA）[15]。PCR產(chǎn)物直接測序法提供的信息量豐富，可檢測已知與未知的突變，缺點是檢測靈敏度較低，常需要血清HBV DNA＞104copies/ml，病毒突變株的比例達20%～25%。INNO LiPA的檢測靈敏度高，最低能夠檢測到5%的突變株，但只能檢測到已知的突變，且現(xiàn)階段分辨同一突變位點（如rt184位點）多種突變形式的能力有限[16]。總之，設計靈敏、簡便、經(jīng)濟的耐藥檢測方法是今后HBV耐藥檢測的一個重要課題。

（二）ADV耐藥的預防方法 有研究證實ADV治療LAM耐藥患者時ADV的耐藥發(fā)生率要比ADV治療初治患者時高，且療程不足會導致肝炎復發(fā)。Ayoub WS等[17]指出需要長期治療的患者單用或聯(lián)合治療核苷（酸）類藥物都能有效地防止耐藥性的發(fā)生發(fā)展。單用治療：有學者認為LAM耐藥的產(chǎn)生讓患者在后續(xù)抗病毒治療中面臨更大的耐藥風險，因此在核苷初治患者啟動抗病毒治療時，可以選擇耐藥基因屏障較高（同時發(fā)生3個或3個以上位點變異才導致耐藥）、抗病毒效應較強的藥物，如恩替卡韋或替諾福韋來預防耐藥的產(chǎn)生[18]。聯(lián)合治療：最近Lampertieo P等[19]應用ADV聯(lián)合LAM治療145例LAM耐藥的CHB患者3年，其中有116例（約80%）出現(xiàn)HBV DNA清除，145例均無臨床學和病毒學的突破。無論HBV DNA的抑制程度如何，rtA181v/T是惟一檢出的與ADV耐藥相關(guān)的變異，在基線時6例（1 rtA181V和5 rtA181T），治療期間增加3例（為rtA181T）。此9例患者中7例在治療期間HBV DNA下降不明顯。rtA181T變異4年累計發(fā)生率為4%。由此可知ADV與LAM聯(lián)合治療可降低HBV對ADV耐藥性。國內(nèi)周淑云等[20]觀察152例ADV治療LAM耐藥CHB患者療效以及ADV的耐藥情況，也證明了此項結(jié)果。

此外，選擇合適的時機進行抗病毒治療、提高患者依從性、早期應答不理想及時換藥等也有助于預防耐藥的發(fā)生。ADV可在治療48周時進行療效評估。如果患者血清HBV DNA未達到檢測值下限，則在此時調(diào)整治療方案以降低后期耐藥的發(fā)生率。

三、ADV耐藥后的挽救治療策略

（一）藥物替代療法 在ADV發(fā)生耐藥后，可選擇和ADV耐藥位點不重疊而且無交叉耐藥的藥物治療。出現(xiàn)rtN236T耐藥可選擇拉米夫定（LAM）、恩替卡韋（ETV）或替比夫定，而對rtA181V突變的菌株LAM、ETV的敏感性有所下降，對替諾福韋敏感性較高。替諾福韋對ADV耐藥者有較好療效，無論是發(fā)生rtA181 V、rtN236T單一突變還是聯(lián)合突變，均對替諾福韋敏感[21]。Laoi BN等[22]使用恩替卡韋成功治療了2例ADV耐藥（分別是rtAl81V和rtAl81T變異）的患者。Schildgen O等[23]使用替諾福韋治療對ADV原發(fā)性耐藥（rtI233V）的3例患者，均取得滿意的效果。

（二）聯(lián)合用藥 ADV耐藥后聯(lián)合用藥的臨床資料報告鮮見。目前推薦，對于發(fā)生ADV耐藥的患者，在臨床上可加用LAM，可能優(yōu)于換成LAM單藥治療。各種抗HBV核苷類似藥物陸續(xù)出現(xiàn)，在一定意義上為聯(lián)合治療提供了條件。聯(lián)合治療能夠增強抗病毒能力和減低耐藥的發(fā)生率。對于LAM耐藥的患者采用LAM+ADV聯(lián)合治療，產(chǎn)生ADV耐藥的概率小于單獨用ADV[24]。但在抗HBV聯(lián)合用藥治療的研究方面還不夠充分[7]。有研究指出，干擾素聯(lián)合ADV使用既克服了單用干擾素對高載量病毒、高ALT水平療效欠佳的缺點，同時也避免了單用ADV容易耐藥及不能夠突然停藥的特點[25]。也有ADV聯(lián)合胸腺肽以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥（甘草酸二胺腸溶液、苦參素等）治療相關(guān)報道。聯(lián)合治療可能是未來抗病毒研究的新熱點。

（三）免疫調(diào)節(jié)治療 HBV感染后可引起人體對HBV的免疫耐受（產(chǎn)生無或低免疫應答），體內(nèi)的HBV不能清除，使得病毒在體內(nèi)的持續(xù)存在和復制。免疫調(diào)節(jié)治療的目的就是打破免疫耐受，恢復病毒特異性T細胞的應答。目前CHB免疫治療多為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，包括胸腺肽、胸腺肽a1、微卡（母牛分枝桿菌制劑）、左旋咪唑搽劑等。特異性免疫調(diào)節(jié)劑包括各種治療性疫苗，如特異性細胞毒性T淋巴細胞多肽疫苗、S和前S2蛋白疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫復合物疫苗、HBV特異性核酸疫苗等[26]。免疫調(diào)節(jié)治療相關(guān)的研究還不夠充分，臨床尚未有統(tǒng)一意見，能否成為抗HBV治療的主力還有待研究。

四、小結(jié)

長期抗病毒治療導致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，是目前抗病毒治療的一大難題。必須高度重視預防HBV多重耐藥毒株的出現(xiàn)，應盡快建立研究HBV耐藥的一系列技術(shù)平臺。耐藥的檢測、預防顯得尤為重要，但目前還不能確定哪一種方法是檢測的“金標準”，將來需要進行更多的試驗研究。另外，基因表型分析能幫助臨床工作者選擇最優(yōu)的治療方案，有利于預防和減少耐藥率。聯(lián)合治療可能是將來治療慢性乙型肝炎的重要趨勢。目前，對聯(lián)合治療的評估研究仍處于初級階段，新的、更安全的、更有效的聯(lián)合治療方案還有待進一步臨床和實驗研究。

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