張 坤 姜妙娜 張彩華 賈玉杰

肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[1]，對HSCs的活化進行干預(yù)是臨床治療肝纖維化的發(fā)展方向[2]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種進化上保守的蛋白激酶，參與多種病理和生理過程，與細胞的生長、分化、增殖、遷移等過程密切相關(guān)[3]。研究表明，在實驗性大鼠肝纖維化模型中應(yīng)用mTOR抑制劑，可降低肝纖維化程度[4]，說明mTOR在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。核糖體S6激酶（P70S6K）是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，從而控制含5'-TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯[5]。研究表明，P70S6K參與了HSC表達膠原的調(diào)控，因而與肝纖維化的發(fā)生關(guān)系密切[6]。但到目前為止，國內(nèi)外有關(guān)mTOR/P70S6K信號通路與肝纖維化發(fā)生關(guān)系的研究甚少。

關(guān)于中藥在分子水平包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的研究還很少。實驗證明肝復(fù)康對肝纖維化具有預(yù)防及治療作用[7～10]。我們通過體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞-T6（Hepatic stellate cell-T6，HSC-T6），以肝復(fù)康進行干預(yù)，進一步探討其抗肝纖維化的作用機制。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng) HSC-T6細胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)許列明教授惠贈。細胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

二、含藥血清的制備[11]健康SD大鼠，雌雄不限，體重300～350g，被隨機分為正常對照組和肝復(fù)康治療組，每組10只，分別給予生理鹽水、肝復(fù)康（4.16ml/只）灌胃，每天一次，共七天。最后一次灌胃前禁食12小時并在灌胃后一小時腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，4℃、3000rpm離心20分鐘，取血清，過濾，56℃滅活30分鐘后分裝，-80℃保存。

三、HSCs實驗 將傳代培養(yǎng)的HSC-T6細胞分為三組：正常對照組：在含10%正常對照組血清的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時；乙醛刺激組：在含10%正常對照組血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L），培養(yǎng)48小時；肝復(fù)康治療組：在含10%肝復(fù)康藥物血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L），培養(yǎng)48小時。

四、大鼠肝星狀細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6K mRNA檢測 采用RT-PCR法。使用TRIzol（Invitrogen公司）提取細胞總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定RNA的質(zhì)量和濃度，在A260/A280為1.18～2.10。使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（TAKARA公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35 個循環(huán)；72℃延伸 7 min。Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6K、β-actin引物序列均采用primer5軟件自行設(shè)計，其引物序列（TAKARA）及擴增產(chǎn)物大小分別為：Ⅰ型膠原：上游：5’-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3’，下游：5’-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3’，產(chǎn)物462bp。Ⅲ型膠原：上游：5’-AGATCATGTCTTGACTCAAGTC-3’， 下 游 ：5’-TTTACATTGCCATTGGCCTGA-3’，產(chǎn)物 463bp。mTOR:上游：5’-CGGGATACTCACGATGGA-3’，下游：5’-GTCAAGTTGCCGAGATGG-3’，產(chǎn)物 447bp。P70S6K：上游 ：5’-TTTTGGCTCGGAAGGTGG-3’， 下 游 ：5’-TGTCGGATTGGAAGTGGC-3’，產(chǎn)物 421bp。β-actin：上游：5’-GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3’，下游：5’-TGATCTT CATGGTGCTAGGAGCC-3’，產(chǎn)物 847bp。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)對DNA條帶進行吸光度掃描，與相應(yīng)β-actin的比值分別為Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6KmRNA的相對表達水平。實驗重復(fù)3次以上，取均值。

五、統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0完成統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用表示，多組比較采用ANOVA法，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

結(jié)果

一、三組HSC-T6細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達 正常對照組有Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，但程度較弱；乙醛刺激組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達量明顯增加，與正常對照組相比有顯著性差異（分別為P＜0.01和P＜0.05）；肝復(fù)康治療組Ⅰ型膠原mRNA的表達量較乙醛刺激組表達量明顯下降，有顯著性差異（P＜0.01），與正常對照組比，表達量增多，有顯著性差異（P＜0.01），肝復(fù)康治療組Ⅲ型膠原mRNA的表達量與正常對照組和乙醛刺激組相比無顯著性差異（P＞0.05，圖 1）。

圖1 各組肝星狀細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、mTOR和P70S6K的表達 泳道1、2和3分別為正常對照組、乙醛刺激組和肝復(fù)康治療組

二、三組HSCs mTOR、P70S6K mRNA的表達 正常對照組有少量mTOR、P70S6K mRNA的表達；乙醛刺激組mTOR、P70S6K mRNA的表達明顯上調(diào)，與正常對照組相比均有顯著性差異（P＜0.01）；肝復(fù)康治療組mTOR、P70S6K mRNA的表達量比乙醛刺激組明顯下調(diào)，均有顯著性差異（P＜0.01），同時與正常對照組相比，表達量增多，有顯著性差異（P＜0.01，圖1）。

討論

乙醛刺激HSCs 是酒精性肝病的主要原因，HSCs在乙醛的刺激下表現(xiàn)為細胞增殖、Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質(zhì)合成增加，乙醛作為HSCs的激活劑被廣泛應(yīng)用于實驗中[12]。在本實驗，乙醛刺激組HSCs表達Ⅰ、Ⅲ型膠原增加，說明HSCs被乙醛激活。

HSCs的活化過程是多條信號通路及一系列細胞信號分子網(wǎng)絡(luò)共同參與作用的結(jié)果。TOR是一種絲/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶，首先在酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了酵母TOR的同源物，稱為mTOR。mTOR在穩(wěn)定狀態(tài)下存在于胞漿內(nèi)，激活后進入胞核調(diào)控下游靶分子4E-BP1和P70S6K。mTOR可以整合細胞內(nèi)外的生長因子和環(huán)境壓力等激發(fā)的信號刺激，從而調(diào)控細胞生長、增殖和細胞周期[13]。P70S6K是一種核糖體蛋白激酶，在細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中廣泛表達和激活，其活性受mTOR、MAPK等多種信號調(diào)節(jié)，活化后能夠磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白，S6蛋白可促進5’TOPmRNA的翻譯，影響細胞的生長和增殖[14]。5’TOPmRNA可翻譯合成核糖體蛋白、延伸因子eEFlα和eEF2以及mRNA穩(wěn)定蛋白PABP等[15]。本實驗中乙醛刺激組mTOR和P70S6K表達量均明顯升高（P＜0.01），說明在肝纖維化時mTOR/P70S6K信號通路起到一定的作用。

中藥具有多組分、多途徑與多靶點的作用特點，針對纖維化等復(fù)雜疾病可發(fā)揮綜合作用。肝復(fù)康是以丹參、黃芪、赤芍、白芍、柴胡為主要成份的復(fù)方中藥，具有活血化瘀、軟堅消癥的功效。本研究顯示，肝復(fù)康治療組HSCs mTOR和P70S6K表達量較乙醛刺激組明顯下調(diào)，說明肝復(fù)康發(fā)揮抗纖維化的治療作用與抑制mTOR/P70S6K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。因此，我們認為mTOR/P70S6K信號通路在HSCs活化、肝纖維化形成過程中起到重要作用。

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