陳秋鳳,周防震

1.湖北民族學(xué)院附屬醫(yī)院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

明膠酶，亦稱Ⅳ型膠原酶[1]、基底膜性膠原酶[2]等，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)范疇，包括明膠酶A(MMP-2或稱72kDaⅣ型膠原酶)和明膠酶B(MMP-9或稱92kDaⅣ型膠原酶)，可降解Ⅳ型膠原、明膠和V型膠原等基底膜成分，在組織炎癥[3]、纖維化[4,5]、免疫[6]與腫瘤轉(zhuǎn)移[7～9]等諸多過(guò)程中發(fā)揮重要作用。明膠酶檢測(cè)方法從最初的明膠酶譜法到現(xiàn)在采用的ELISA法，從粗略定性到逐漸發(fā)展為準(zhǔn)確定量，方法穩(wěn)定性、可靠性逐漸完善，操作也變得更為簡(jiǎn)單。本文就明膠酶測(cè)定方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基于明膠酶催化活性的檢測(cè)方法

利用明膠酶能催化降解明膠的特點(diǎn)發(fā)展建立起來(lái)的檢測(cè)方法主要有明膠酶譜法(Zymography)、熒光明膠酶法和DQ明膠(Dye-quenched-gelatin)原位酶譜法。

1.1明膠酶譜法Kleiner等[10]于1994建立此方法，是一種基于非還原SDS-PAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法。主要原理是：1)含明膠酶的樣本首先上樣進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳，利用明膠酶與陰離子去垢劑SDS結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使待測(cè)蛋白質(zhì)帶上相同的負(fù)電荷，其量大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，此時(shí)蛋白質(zhì)分子在凝膠中的遷移率取決于其分子質(zhì)量大??；2)SDS-PAGE電泳后利用含陽(yáng)離子去垢劑(Triton-x 100)的洗脫液洗脫去除SDS，這一過(guò)程中引發(fā)了明膠酶酶原蛋白體外活化機(jī)制，酶原在凝膠內(nèi)除掉一個(gè)約10 kDa的小肽，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿竅11]，降解凝膠中相應(yīng)部位的明膠。已經(jīng)被激活的明膠酶在去除SDS后也可以恢復(fù)酶活性[12]；3)然后經(jīng)過(guò)短暫漂洗后將凝膠放入孵育液中進(jìn)行孵育，這時(shí)明膠酶分解凝膠中的底物明膠；最后進(jìn)行顯色、脫色后可見(jiàn)藍(lán)色背景下的白色條帶。該方法系最早建立的明膠酶檢測(cè)方法，是目前最為常用的明膠酶檢測(cè)方法，分為酶原和活化型酶兩種形式，費(fèi)用低、簡(jiǎn)便、敏感，適合血漿、組織細(xì)胞蛋白提取物或細(xì)胞培養(yǎng)上清等多種形式樣本的分析，但只能半定量分析MMPs活性，且需要組織勻漿或血清分離等過(guò)程，容易導(dǎo)致蛋白降解及部分酶活性丟失，也無(wú)法進(jìn)行組織定位觀察。

1.2 EnzChek熒光明膠酶檢測(cè)法Molecular Probes公司于2001推出此方法，是用熒光膠體偶聯(lián)物代替普通明膠而建立起來(lái)的一種方法。主要檢測(cè)要點(diǎn)是：1)獲得含明膠酶的樣本；2)含膠原酶的樣本與熒光膠體偶聯(lián)物DQ-明膠共孵育，樣本中的明膠酶分解熒光明膠，釋放熒光肽，熒光的增加量與樣本中明膠酶的活性成正比，利用熒光光度計(jì)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可定量確定明膠酶的量。該方法將明膠酶的活性與化學(xué)發(fā)光技術(shù)巧妙結(jié)合，具有高敏、快速、方便和直觀等優(yōu)點(diǎn)，適合多種形式樣本的分析，特別是適合明膠酶活性抑制劑的高通量篩選。但缺點(diǎn)在于試劑盒費(fèi)用高，且操作過(guò)程中仍然需要組織勻漿或血清分離等過(guò)程，且無(wú)法進(jìn)行組織定位觀察。

1.3 DQ明膠原位酶譜法該方法既綜合了傳統(tǒng)明膠酶譜法和EnzChek熒光明膠酶檢測(cè)法兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，又克服了形態(tài)定位缺乏之不足，是建立在冰凍切片基礎(chǔ)上進(jìn)行的明膠酶活性分析方法。主要檢測(cè)要點(diǎn)是[13]：1)制備組織超薄冰凍切片；2)制備10 g/L的瓊脂糖液，4℃放置備用；3)10 g/L的瓊脂糖液于100℃溫浴至液體析出，吸出瓊脂糖析出液；4)利用瓊脂糖析出液10倍稀釋1 kg/L 的DQ-明膠，充分混勻；5)每片組織超薄冰凍切片滴加50 μL DQ-明膠/瓊脂糖析出液混合液，4℃避光5 min；6)將組織超薄冰凍切片置于反應(yīng)液中，37℃避光孵育8～24 h；7)PBS洗滌和熒光顯微鏡下檢測(cè)觀察。

2 基于明膠酶抗原性的檢測(cè)方法

明膠酶具有大分子蛋白的共性——抗原性，利用此特性發(fā)展建立起來(lái)的基于抗原抗體特異結(jié)合的明膠酶檢測(cè)體系包括免疫組化分析、Western blot分析和ELISA分析。

2.1免疫組化分析法該方法是迄今原位檢測(cè)組織蛋白最直觀、應(yīng)用最廣的方法，在檢測(cè)明膠酶蛋白的試驗(yàn)中，它不僅可以提供各種腫瘤間、各種因子間半定量的比較數(shù)據(jù)，更重要的是能象DQ明膠原位酶譜法一樣做到組織定位，從而能夠從形態(tài)學(xué)上反映明膠酶的表達(dá)規(guī)律。田鯤等[14]利用免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)黏液表皮樣癌中明膠酶主要表達(dá)在表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞，黏液細(xì)胞著色少；腺樣囊性癌中，條索狀實(shí)性區(qū)域上皮細(xì)胞表達(dá)明膠酶強(qiáng)于腺管-篩孔樣區(qū)域，從而認(rèn)為黏液細(xì)胞分化相對(duì)成熟，而表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞分化較低，顯示較強(qiáng)的侵襲活性。但是由于實(shí)驗(yàn)中主觀因素干擾較多導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差，如陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱容易受室溫、空氣濕度、溶液離子濃度等因素的影響，各批次著色程度也存在較大差異，另外陽(yáng)性判斷也因主觀認(rèn)識(shí)不一而有所差異。該方法穩(wěn)定性差、不能準(zhǔn)確定量比較，從而限制了其普遍的應(yīng)用。

2.2 Western blot分析收集含明膠酶樣本(細(xì)胞培養(yǎng)液或組織細(xì)胞蛋白提取液)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到NP膜或者PVDF膜，封閉，與一抗(抗MMP-2或MMP-9抗體)及二抗(HRP標(biāo)記)依次孵育，利用ECL試劑盒對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[15～17]。Western blot分析法，特異性強(qiáng)，靈敏度高，選擇合適內(nèi)參可以準(zhǔn)確定量，結(jié)果可靠，但是成本較高，需要購(gòu)買(mǎi)抗MMP-2或MMP-9抗體、內(nèi)參抗體以及二抗，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且一次檢測(cè)的通量有限。

2.3酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) ELISA分析法綜合了Western blot分析法特異性強(qiáng)、靈敏度高和可定量的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼有操作簡(jiǎn)單，獲得結(jié)果快，檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，使測(cè)定達(dá)到很高的靈敏度和穩(wěn)定性，尤其適合大批量樣本中明膠酶的檢測(cè)，以及靶向明膠酶的藥物抑制劑的高通量篩選。但該方法需要價(jià)格昂貴的酶標(biāo)儀等多孔板讀板儀。

3 結(jié)論與展望

從Kleiner1994年建立明膠酶譜法到現(xiàn)在，明膠酶的測(cè)定方法伴隨分子生物學(xué)分析技術(shù)進(jìn)步而不斷更新，目前已有基于明膠酶催化活性和抗原性兩大類(lèi)6種方法可供選擇。各種方法側(cè)重點(diǎn)不盡相同，免疫組織化學(xué)和DQ-明膠原位酶譜法重點(diǎn)在蛋白的組織定位和半定量；EnzChek熒光明膠酶檢測(cè)、Western blot和ELISA幾種方法在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的前體下可以做到蛋白定量檢測(cè)，而明膠酶譜法則能夠區(qū)分酶原和活化酶。若綜合考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備、技術(shù)手段和經(jīng)費(fèi)預(yù)算等多方面因素，最常用的還是明膠酶譜、熒光明膠酶檢測(cè)和免疫組化三種方法。ELISA測(cè)定明膠酶的方法，具有快速，高通量和可以準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)組織炎癥、腫瘤等發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中明膠酶的變化，以及患者在治療過(guò)程中明膠酶的變化，將成為臨床早期診斷、治療和預(yù)后的重要檢測(cè)手段。

[1]Hrabec E,Naduk J,Strek M,et al.Type IV collagenases (MMP-2 and MMP-9) and their substrates--intracellular proteins, hormones,cytokines, chemokines and their receptors[J].Postepy Biochem,2007,53:37-45.

[2]Cheng S,Pollock AS,Mahimkar R,et al.Matrix metalloproteinase 2 and basement membrane integrity:a unifying mechanism for progressive renal injury[J].FASEB J,2006,20:1898-1900.

[3]Le NT, Xue M, Castelnoble LA,et al.The dual personalities of matrix metalloproteinases in inflammation[J]. Front Biosci,2007,12:1475-1487.

[4]Reif S,Somech R,Brazovski E,et al.Matrix metalloproteinases 2 and 9 are markers of inflammation but not of the degree of fibrosis in chronic hepatitis C[J].Digestion,2005,71:124-130.

[5]Hemmann S,Graf J,Roderfeld M,et al.Expression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis-a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies[J].J Hepatol,2007,46:955-975.

[6]Li J, Leschka S, Rutschow S,et al.Immunomodulation by interleukin-4 suppresses matrix metalloproteinases and improves cardiac function in murine myocarditis[J].Eur J Pharmacol,2007,554:60-68.

[7]Martin MD,Matrisian LM.The other side of MMPs:protective roles in tumor progression[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26:717-724.

[8]Mook OR,Frederiks WM,Van Noorden CJ.The role of gelatinases in colorectal cancer progression and metastasis[J].Biochim Biophys Acta,2004,1705:69-89.

[9]Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2006,25:9-34.

[10]KleinerDE,Stetler-StevensonWG.Quantitativezymography:detectionofpicogramquantities ofgelatinases[J].AnalBiochem,1994,218:325-329.

[11]Laemmli,U. K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.

[12]Basset P,Bellocq J P,Wolf C,et al.A novel metalloproteinase gene specifically expressed in stromal cells of breast carcinomas[J].Cell Res,1999,9:291-303.

[13]陳倩,沈麗,何琦麟,等.熒光原位明膠酶譜法對(duì)肝組織明膠酶活性的檢測(cè)[J].世界華人消化雜志,2008,16(15):1607-1611.

[14]田鯤，彭敏，陳宇，等.免疫組化、明膠酶譜、Western Blot 檢測(cè)涎腺腫瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2,MMP-9表達(dá)的比較與評(píng)價(jià)[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志,2010,7(5):17-21.

[15]Li Z,Li L,Zielke H R,et al.Increased expression of 72-kd type IV collagenase (MMP-2) in human aortic atherosclerotic lesions[J].The American journal of pathology,1996,148(1):121-128.

[16]劉虹彬，溫進(jìn)坤，韓梅.氧化型低密度脂蛋白對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9表達(dá)的影響[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2001，9(1):10-13.

[17]Mendes O,Kim H T,Lungu,G,et al.MM-2 role in breast cancer brain metastasis development and its regulation by TIMP2 and ERK1/2[J].Clinical and Experimental Metastasis,2007,24:341-351.