黎海莉，杜 鵑，劉雅坤，劉曉云，康 林*，崔慧先

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

左旋18-甲基炔諾酮對(duì)大鼠垂體黃體生成素細(xì)胞形態(tài)及血清濃度的影響

黎海莉1，杜 鵑2，劉雅坤1，劉曉云2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的分析左旋18-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）對(duì)大鼠垂體黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細(xì)胞形態(tài)和血清濃度的影響。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析，觀察應(yīng)用LNG后大鼠垂體LH細(xì)胞的變化，同時(shí)應(yīng)用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定血清LH濃度。結(jié)果短期實(shí)驗(yàn)組大鼠LH細(xì)胞形狀變圓（P＜0.05），灰度加深（P＜0.05），而細(xì)胞數(shù)量和平均面積無明顯改變（P＞0.05）；長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組大鼠LH細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量和平均面積減少（P＜0.01）；短期和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組大鼠血清LH濃度均下降（P＜0.01）；停藥后LH細(xì)胞數(shù)量，平均面積及血清LH濃度逐步恢復(fù)正常（P＜0.01）。結(jié)論應(yīng)用LNG可以引起大鼠垂體LH細(xì)胞形態(tài)及血清LH濃度的改變，但這一過程是可恢復(fù)的。短期應(yīng)用主要作用部位在垂體前葉。長(zhǎng)期應(yīng)用同時(shí)抑制了下丘腦GnRH的合成與分泌，從而抑制排卵。

甲基炔諾酮；垂體；黃體激素類；大鼠

單純?cè)屑に乜诜茉兴?，?duì)哺乳期婦女和想使用口服形式避孕的婦女，是一種很好的避孕方法［1-2］。目前，涉及下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的研究報(bào)道多集中于生殖藥理學(xué)、生化學(xué)與臨床研究方面［3-4］，缺乏單純?cè)屑に乇茉兴帉?duì)下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調(diào)節(jié)的形態(tài)學(xué)資料。在單純?cè)屑に乇茉兴幾笮?8-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）的長(zhǎng)期作用下，大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotroPin-relasing hormone，GnRH）陽性神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變：光密度減低；棘型GnRH神經(jīng)元減少，棘突觸數(shù)量減少，纖維膨體數(shù)下降，長(zhǎng)期應(yīng)用LNG，可使下丘腦GnRH神經(jīng)元的功能處于非活躍狀態(tài)［5］。我們還證實(shí)下丘腦神經(jīng)肽Y神經(jīng)元參與了LNG長(zhǎng)期作用下GnRH分泌的調(diào)節(jié)［6］，同時(shí)下丘腦弓狀核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核雌激素受體也參與了這一反饋調(diào)節(jié)過程［7］。但是在垂體水平，LNG對(duì)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細(xì)胞形態(tài)及血清LH的影響還未見報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)并結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)對(duì)大鼠應(yīng)用LNG后垂體LH細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化以及血清LH濃度的變化，進(jìn)行了觀察、分析和初步探討，以期為臨床避孕藥物的應(yīng)用提供形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組：健康成年雌性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～250g（河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），自然光照、室溫（22±3）℃、自由飲食飲水飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組大鼠分為短期實(shí)驗(yàn)組7只（喂藥20d），長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組7只（喂藥90d）和停藥實(shí)驗(yàn)組7只（停藥后繼續(xù)普通喂養(yǎng)20d）。實(shí)驗(yàn)組大鼠每天上午9時(shí)左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1·d-1，對(duì)照組（15只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依據(jù)陰道涂片結(jié)果分別將處于動(dòng)情期的實(shí)驗(yàn)組及其相應(yīng)對(duì)照組的大鼠稱質(zhì)量，心臟取血后迅速使用4%多聚甲醛經(jīng)主動(dòng)脈行灌流固定，靜置1h。所取心臟血樣，室溫下低速離心（2 000r/min）20min，-20℃?zhèn)溆么郎y(cè)。取垂體入Bouin液固定12h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，用組織切片機(jī)從垂體頭側(cè)向尾側(cè)做冠狀連續(xù)切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚賴氨酸的載片上。每例垂體連續(xù)集片于10組載玻片（同一載玻片相鄰兩張切片間隔40μm）（圖1A，B），入37℃溫箱內(nèi)干燥24h，備用。

1.3 免疫組織化學(xué)法：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水、依次進(jìn)入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4），3%過氧化氫（甲醇稀釋）常溫孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠β-LH單克隆抗體（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供，PBS 1∶7 000稀釋），4℃冰箱過夜。生物素標(biāo)記的1∶100兔抗鼠IgG（北京中山生物技術(shù)有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育30min。1∶100辣根過氧化物酶的鏈霉卵白素（北京中山生物技術(shù)有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育30min。用DAB-H2O2顯色3min，自來水停顯、脫水、透明、中性樹膠封固（圖1C，D）。

1.4 計(jì)算機(jī)圖像分析：根據(jù)大鼠垂體冠狀切面上前葉、中間葉和后葉出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)特征，每只大鼠分別在垂體頭端部、中間部和尾端部選擇典型切片各1片。具體標(biāo)準(zhǔn)為，頭端部，神經(jīng)葉和中間葉等寬處；中間部，神經(jīng)葉最寬處；尾端部，神經(jīng)葉剛消失，只剩中間葉和前葉組織處。應(yīng)用ZL-2000型計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，在相應(yīng)切片上分別對(duì)單位視野內(nèi)（0.01mm2）LH細(xì)胞的數(shù)量及其面積，平均灰度和形狀等參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 血清LH濃度測(cè)定：應(yīng)用美國(guó)德普公司自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（IMMULITE系統(tǒng)）及原裝試劑盒測(cè)定血清LH濃度。該方法是一種固相、雙位點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)量法，固相為聚乙烯珠，包被有抗所測(cè)激素的特異性單克隆抗體，與血中激素結(jié)合后再與堿性磷酸酯多克隆抗體形成復(fù)合物，加入化學(xué)發(fā)光底物，通過溫控光度計(jì)測(cè)量光子量，應(yīng)用計(jì)算機(jī)內(nèi)存Master's曲線計(jì)算結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

垂體HE染色切片光鏡觀察，可見腺細(xì)胞排列成不規(guī)則的索和團(tuán)狀，少數(shù)成濾泡狀，細(xì)胞間有豐富的竇狀毛細(xì)血管（圖1B）。大鼠腺垂體LH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈淺褐色，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，常位于竇狀毛細(xì)血管附近，在大鼠垂體頭端部的腹側(cè)區(qū)，頭端部和尾端部的背側(cè)區(qū)及鄰近中間葉的兩側(cè)翼數(shù)量多（圖1D），胞體較大（圖2A）。我們應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)垂體單位視野內(nèi)LH細(xì)胞的數(shù)量及其面積、平均灰度和圓形度等參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。

2.1 LNG對(duì)大鼠LH細(xì)胞面積的影響：短期實(shí)驗(yàn)組LH細(xì)胞面積（149.6±16.54）μm2和停藥實(shí)驗(yàn)組（151.27±33.38）μm2，與各自對(duì)照組（151.45± 18.41）μm2、（160.93±22.81）μm2相比（圖2），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組（124.85±22.27）μm2與長(zhǎng)期對(duì)照組（163.72± 24.97）μm2相比，細(xì)胞面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組間縱向比較，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞面積最小，與短期實(shí)驗(yàn)組和停藥實(shí)驗(yàn)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 LNG對(duì)大鼠LH細(xì)胞數(shù)量的影響：?jiǎn)挝灰曇皟?nèi)LH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)量，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組（7.44± 1.21）個(gè)，少于長(zhǎng)期對(duì)照組的（9.42±0.42）個(gè)（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；停藥實(shí)驗(yàn)組（8.60±0.45）個(gè)，少于停藥對(duì)照組的（9.02±0.33）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各實(shí)驗(yàn)組間縱向比較，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目最少，分別與短期實(shí)驗(yàn)組和停藥實(shí)驗(yàn)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 LNG對(duì)大鼠LH細(xì)胞平均灰度的影響：短期實(shí)驗(yàn)組56.83±3.63與短期對(duì)照組61.49±3.94相比，細(xì)胞灰度加深（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組58.33±2.81和停藥實(shí)驗(yàn)組60.06±3.37與各自對(duì)照組60.43±3.74、60.19± 2.27相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 LNG對(duì)大鼠LH細(xì)胞形狀的影響：細(xì)胞形狀用圓形度定量描述截面形態(tài)和圓的相差程度，若細(xì)胞截面為圓時(shí)，圓形度為1，當(dāng)截面非圓時(shí)，圓形度＜1，界面越不規(guī)則，圓形度越小。LH細(xì)胞的圓形度，短期實(shí)驗(yàn)組0.75±0.015與短期對(duì)照組0.72± 0.014相比，形狀變圓（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組0.70±0.035與長(zhǎng)期對(duì)照組0.71±0.015相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥實(shí)驗(yàn)組0.69±0.04與停藥對(duì)照組0.71±0.012相比，細(xì)胞形狀不規(guī)則，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 LNG對(duì)大鼠血清LH濃度的影響：短期實(shí)驗(yàn)組（183.9±14.77）mU/L、長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組（177.76± 9.95）mU/L與短期對(duì)照組（212.48±16.33）mU/L、長(zhǎng)期對(duì)照組（215.42±13.80）mU/L相比，血清LH濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。停藥實(shí)驗(yàn)組（204.36±14.50）mU/L與停藥對(duì)照組（209.36±9.91）mU/L相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組相比，血清LH濃度上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

正常的排卵依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸的精密調(diào)控。其中，下丘腦分泌的GnRH對(duì)垂體的影響有2種效應(yīng)。首先，GnRH能促進(jìn)LH的合成與釋放。其次GnRH能在LH第2次作用于垂體前葉時(shí)，使其釋放更容易，LH峰值也明顯高于第1次［8-9］。而孕酮?jiǎng)t可降低此反應(yīng)，使LH分泌下降，這可能與孕激素降低垂體雌激素受體數(shù)目有關(guān)［7］。這種反應(yīng)還同血中雌、雄激素水平有關(guān)。正常動(dòng)情周期中，在促性腺激素的作用下，卵泡逐步生長(zhǎng)、成熟，使內(nèi)源性雌激素水平逐步升高。雌激素水平升高可觸發(fā)和增強(qiáng)GnRH對(duì)垂體的效應(yīng)，并使大鼠垂體GnRH受體數(shù)量增加，從而激發(fā)LH、FSH分泌高峰，引起排卵。雄激素則表現(xiàn)出抑制作用，睪酮能與垂體雄激素受體結(jié)合，直接抑制LH分泌［10］。

LNG是第2代全合成孕激素類藥物，為19-去甲基-睪酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是強(qiáng)有力的孕激素，并具有一定雄激素和抗雌激素活性。本實(shí)驗(yàn)觀察到短期應(yīng)用LNG后，圓形LH細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞的平均灰度加深，血清LH濃度下降。這表明激素分泌減少，分泌顆粒在細(xì)胞內(nèi)聚集，使細(xì)胞變圓，免疫陽性反應(yīng)加強(qiáng)。由此可以認(rèn)為，短期應(yīng)用LNG后，LH細(xì)胞內(nèi)仍有少量激素合成，并形成分泌顆粒。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，長(zhǎng)期應(yīng)用LNG后，垂體LH細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞變小，數(shù)量減少，血清LH濃度下降。其主要原因可能是GnRH水平下降或其分泌的脈沖頻率、幅度的改變，導(dǎo)致LH的合成與分泌處于停滯。由于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無LH形成，LH分泌顆粒很少，甚至用較敏感的SP免疫組織化學(xué)方法也不能顯示，表現(xiàn)為免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞變小，數(shù)量減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短期應(yīng)用LNG達(dá)到抑制排卵的作用是多環(huán)節(jié)的，其關(guān)鍵作用部位在垂體前葉。而長(zhǎng)期應(yīng)用LNG是抑制了下丘腦GnRH的合成與分泌［2-3］，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，停藥后大鼠垂體LH細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的分布及大小均逐漸接近正常情況，血清LH濃度也逐步恢復(fù)正常水平。應(yīng)用LNG對(duì)腺垂體細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)分泌活動(dòng)的影響是暫時(shí)的，停藥后可逐漸恢復(fù)正常。LNG是一安全、高效、可逆的孕激素類避孕藥物。（本文圖見封二）

【參考文獻(xiàn)】

［1］KRIKUN G，BOOTH CJ，BUCHWALDER L，et al.Long-term Progestin-only contracePtion in humans versus animal models［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1221（3）：119-123.

［2］BURKE AE.The state of hormonal contracePtion today：benefits andrisksofhormonalcontracePtives：Progestin-only contracePtives［J］.Am J Obstet Gynecol，2011，205（4 SuPPl）：14-17.

［3］CHEN BA，REEVES MF，CREININ MD，et al.PostPlacental or delayed levonorgestrel intrauterine device insertion and breastfeeding duration［J］.ContracePtion，2011，84（5）：499-504.

［4］SITRUK-WARE R，NATH A.The use of newer Progestins for contracePtion［J］.ContracePtion，2010，82（5）：410-417.

［5］崔慧先，劉曉云，康林，等.左旋18-甲基炔諾酮對(duì)大鼠下丘腦GnRH神經(jīng)元的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2005，28（2）：182-184.

［6］劉曉云，崔慧先，劉力斗，等.LNG對(duì)大鼠下丘腦內(nèi)NPY神經(jīng)元的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26（11）：1266-1267.

［7］劉力斗，劉曉云，卜暉，等.左旋18-甲基炔諾酮對(duì)大鼠雌激素水平及下丘腦雌激素受體陽性細(xì)胞的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2008，31（2）：162-165.

［8］DUNGAN LEMKO HM，NADERI R，ADJAN V，et al.Interactions between neurotensin and GnRH neurons in the Positive feedback control of GnRH/LH secretion in the mouse［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（1）：E80-88.

［9］BANGA FR，HUIRNE JA，ORSEN TK，et al.Pituitary sensitizing effect of GnRH antagonists：a mechanism exPlaining LH escaPe during IVF［J］.Hum ReProd，2010，25（6）：1513-1519.

［10］MAEDA K，OHKURA S，UENOYAMA Y，et al.Neurobiological mechanisms underlying GnRH Pulse generation by hyPothalamus［J］.Brain Res，2010，1364（12）：103-115.

（本文編輯：趙麗潔）

THE EFFECTS OF LEVONORGESTREL ON THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY LH CELLS AND SERUM LH LEVEL IN RATS

LI Haili1，DU Juan2，LIU Yakun1，LIU Xiaoyun2，KANG Lin2*，CUI Huixian2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morPhological alternations of Pituitary luteinizing hormone（LH）cells and the serum concentrations of levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe Pituitary LH cells were identified by immunohistochemistry and comPuter images analysis system.The serum concentrations of LH were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn short-term treated grouP，the shaPe of LH cells became round（P＜0.01）and the gray level（P＜0.05）of LH cells increased，while the number and mean area of LH cells had no significant difference as comPared with that in control grouP（P＞0.05）.In long-term treated grouP，the number and mean areas of LH cells decreased（P＜0.01）and the shaPe became irregular.The serum concentrations of LH were significantly lower in treated grouP than those of control grouP in both terms（P＜0.01）.After ceasing treatment，these changed features recovered to normal gradually（P＜0.01）.ConclusionLNG caused changes of morPhology of LH cells and concentrations of LH in serum，but these changes can return to normal afterceasing treatment.The decrease of the Pituitary resPonse to GnRH caused by short-term treatment of LNG Play an imPortant role on antiovulation，while long-term effects PerhaPs also involve central mechanisms such as influence on hyPothalamus，making synthesis and release of GnRH decrease.

norgestrel；Pituitary；corPus luteum hormones；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）05-0497-04

2012-02-02；

2012-04-05

河北省科技廳博士基金課題（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事生殖內(nèi)分泌學(xué)以及婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.001