王 妍，王 雪，李 越，李志平，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

包埋-交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備及酶學(xué)性質(zhì)

王 妍，王 雪，李 越，李志平，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為得到可重復(fù)使用且活力較高的固定化磷脂酶A1，采用包埋-交聯(lián)酶聚集體的方法對磷脂酶A1進(jìn)行固定，對固定化條件和部分酶學(xué)特性進(jìn)行優(yōu)化和研究，確定最佳條件為：酶液質(zhì)量濃度0.06g/mL、沉淀劑飽和度80%、沉淀pH6、沉淀時間35min、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.4%、交聯(lián)時間6.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、Ca2+濃度0.25mol/L。得到包埋-交聯(lián)磷脂酶聚集體A1的酶活回收率為80.2%。固定化酶熱穩(wěn)定性增強，重復(fù)使用7次相對酶活力保留在65%以上。

磷脂酶A1；沉淀劑；戊二醛；交聯(lián)酶聚集體；固定化；包埋；掃描電鏡(SEM)

磷脂酶A1在磷脂改性、油脂精煉等方面有廣泛應(yīng)用，但游離磷脂酶A1價格昂貴，且不易回收，催化水解時條件苛刻；與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性時，還呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等優(yōu)點[1]。

交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)[2-5]是一類新型的固定化酶技術(shù)，具有制備簡單、酶活回收率高、操作和保存穩(wěn)定性強等優(yōu)點，被廣泛運用于固定化酶的制備中。近年來，CLEAs技術(shù)與材料學(xué)、印跡工程、介質(zhì)工程、反應(yīng)工程學(xué)等相結(jié)合取得了一系列新進(jìn)展，包括載體固定化CLEAs[6]、包埋CLEAs、印跡法CLEAs[7]、多酶CLEAs、CLEAs膜漿反應(yīng)器等，在手性分子拆分與合成、抗生素生產(chǎn)等領(lǐng)域取得了一些成果[8-10]。有些酶的CLEAs相對游離酶的酶活回收率竟超過100%[11]，某些脂酶的交聯(lián)酶聚集體活性甚至可提高10倍以上[12]；有些酶的CLEAs對耐熱性、穩(wěn)定性、對抗血清蛋白水解酶的能力上比游離酶有更高的穩(wěn)定性[13]。但是由于其不易回收等缺點，使酶的重復(fù)利用率降低，因此為得到活力高且回收率高的固定化酶，本實驗在交聯(lián)酶聚集體技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，先將游離磷脂酶A1制成交聯(lián)酶聚集體，再將得到交聯(lián)酶聚集體進(jìn)行包埋，得到固定化磷脂酶A1。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

磷脂酶A1丹麥諾維信公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉、檸檬酸、海藻酸鈉、戊二醛、考馬斯亮藍(lán)、氫氧化鈉均為分析純。

722E型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；電子微量天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C型pH計 上海偉業(yè)儀器廠；79-2雙向磁力加熱攪拌器上海卓康生物科技有限公司；LGJ-1型冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；S-3400N型掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 磷脂酶A1聚集體的制備

將1mL磷脂酶A1(游離酶活力：實測為3500U/g加入到一定量pH值為6.0的磷酸二氫鈉與檸檬酸緩沖液中(0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、0.1mol/L檸檬酸溶液)，將無水乙醇作為沉淀劑，在0℃條件下緩慢加入其中并持續(xù)攪拌，以保證酶聚集體顆粒均勻。冰浴反應(yīng)一段時間，然后于10000r/min離心30min，收集沉淀。

1.2.2 包埋-交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備

將聚集體加入到一定體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液中，攪拌反應(yīng)一段時間，離心去除上清液，用緩沖液沖洗交聯(lián)酶聚集體數(shù)次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮。在20mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液中加入酶聚集體1mL，攪拌均勻。靜置一段時間后，用滅菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s的速度注入于一定濃度CaCl2溶液中制成微膠囊，將形成的微膠囊在4℃的CaCl2溶液中放置一段時間使其進(jìn)一步硬化。然后抽濾得到硬化的微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3～5次，以洗去表面的CaCl2，再進(jìn)行冷凍干燥備用。

1.2.3 交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備及包埋條件的正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交表進(jìn)行交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備及包埋條件的正交試驗研究，以酶活回收率為指標(biāo)，確定最佳戊二醛體積分?jǐn)?shù)、交聯(lián)時間、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)及Ca2+濃度4個反應(yīng)條件，以得到酶活回收率更高的固定化磷脂酶。試驗方案見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.4 游離磷脂酶酶活力測定

參照文獻(xiàn)[14]方法測定。

1.2.5 固定化磷脂酶酶活力測定

稱取一定質(zhì)量的經(jīng)干燥后的固定化酶，經(jīng)復(fù)水后，按照游離磷脂酶活力測定的方法進(jìn)行相應(yīng)的測定。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法[15]測定。

1.2.7 蛋白質(zhì)沉淀率測定

式中：a1為固定化后酶液剩余蛋白質(zhì)含量；a2為固定化前酶液的蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 固定化酶酶活回收率的計算

1.2.9 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.9.1 最適溫度

在酶液質(zhì)量濃度0.006g/mL、沉淀劑飽和度80%、沉淀pH6、沉淀時間35min、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.4%、交聯(lián)時間6.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、Ca2+濃度0.25mol/L的條件下固定酶和游離酶，在40～65℃范圍內(nèi)每隔5℃測定固定化酶和游離酶的相對酶活力。

1.2.9.2 最適pH值

以50mL、5%粉末磷脂溶液為底物，在50℃條件下，進(jìn)行酶解反應(yīng)，在pH4.3～6.8范圍內(nèi)測定游離酶和固定化酶的相對酶活力。

1.2.9.3 操作穩(wěn)定性

以50mL、5%粉末磷脂溶液為底物，在50℃、pH4.8條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別在相同條件下連續(xù)進(jìn)行7批次操作，測定其酶活力，以第一批次酶活力作為100%計算相對酶活力。

1.2.10 固定化酶結(jié)構(gòu)與表征研究

采用掃描電鏡對固定化酶樣品進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂酶A1聚集體的制備

2.1.1 磷脂酶溶液質(zhì)量濃度的確定

在沉淀劑飽和度為70%、沉淀pH值為5、沉淀時間為25min的條件下，選擇不同質(zhì)量濃度的磷脂酶液進(jìn)行沉淀聚集，考察其對酶活回收率的變化規(guī)律，結(jié)果見圖1。

圖1 磷脂酶液質(zhì)量濃度對聚集體活性的影響Fig.1 Effect of free enzyme concentration on the activity of PLA aggregate

由圖1可知，酶活回收率隨著游離酶添加量的增加逐漸增大，但當(dāng)酶添加量大于0.06g/mL時隨著酶添加量的增加活力逐漸降低，所以選擇酶添加量為0.06g/mL。

2.1.2 沉淀劑飽和度的確定

在磷脂酶溶液質(zhì)量濃度為0.06g/mL、沉淀pH值為5、沉淀時間為25min的條件下，選擇不同飽和度的無水乙醇對磷脂酶進(jìn)行沉淀，考察其對蛋白質(zhì)沉淀率和酶活回收率的變化規(guī)律，結(jié)果見圖2。

圖2 沉淀劑飽和度對磷脂酶聚集體活性的影響Fig.2 Effect of precipitant saturation degree on the activity of PLA aggregate

由圖2可知，隨著沉淀劑飽和度的增加，酶聚集體活力和蛋白質(zhì)沉淀率都呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)飽和度為75%時，酶聚集體活力最高。但此時蛋白質(zhì)沉淀率損失較多，當(dāng)飽和度為80%時，蛋白質(zhì)沉淀率達(dá)到90%以上。綜合來看，選擇沉淀劑飽和度為80%最佳。

2.1.3 沉淀pH值的確定

在磷脂酶溶液質(zhì)量濃度為0.06g/mL、沉淀飽和度為80%、沉淀時間為25min的條件下，選擇不同pH值對磷脂酶進(jìn)行沉淀，考察其對蛋白質(zhì)沉淀率和酶活回收率的變化規(guī)律，結(jié)果見圖3。

圖3 沉淀pH值對磷脂酶聚集體活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of PLA aggregate

由圖3可知，當(dāng)pH值為7時，蛋白質(zhì)沉淀率最高，但此時相對酶活力損失較多；當(dāng)pH值為5時，酶聚集體相對活力最高，但此時蛋白質(zhì)沉淀率損失較多。綜合來看，pH值為6時蛋白質(zhì)沉淀率和酶聚集體相對活力都在90%以上，所以選擇pH值為6最佳。

2.1.4 沉淀時間的確定

在磷脂酶溶液質(zhì)量濃度為0.06g/mL、沉淀飽和度為80%、沉淀pH值為6的條件下，選擇不同沉淀時間來制備磷脂酶聚集體，考察其對酶活回收率的變化規(guī)律，結(jié)果見圖4。

圖4 沉淀時間對磷脂酶聚集體活性的影響Fig.4 Effect of precipitation time on the activity of PLA aggregate

由圖4可知，酶活回收率隨著沉淀時間的增加而逐漸增大，在沉淀35min時，酶活回收率達(dá)到最大值，而后隨著沉淀時間的增加而降低。因此選擇沉淀時間為35min最佳。

2.2 交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備及包埋條件的確定2.2.1戊二醛體積分?jǐn)?shù)的確定

在交聯(lián)時間為4.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、Ca2+濃度為0.2mol/L的條件下，以戊二醛作為交聯(lián)劑，考察不同體積分?jǐn)?shù)交聯(lián)劑對酶活回收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對磷脂酶固定化的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized PLA

由圖5可知，隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)增加，固定化酶酶活回收率先增加后降低，這是因為戊二醛體積分?jǐn)?shù)增加時，戊二醛和磷脂酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，酶流失減少，酶活回收率也隨著增加，但進(jìn)一步增加戊二醛體積分?jǐn)?shù)將導(dǎo)致酶活力下降，主要因為酶分子活性基團(tuán)被戊二醛過多的修飾，導(dǎo)致酶活力降低。所以選擇戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為0.3%。

2.2.2 交聯(lián)時間的確定

在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.3%、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、Ca2+濃度為0.2mol/L的條件下，考察不同固定時間對酶活回收率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 交聯(lián)時間對磷脂酶固定化的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on the immobilization of PLA

由圖6可知，開始固定化時，由于包埋逐漸緊密，流失減少，固定化酶活回收率呈升高趨勢；6.5h時固定化酶活達(dá)到最大，再延長時間只會使Ca2+與酶作用，降低活性，因此6.5h為最佳固定化時間。

2.2.3 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.3%、交聯(lián)時間為6.5h、Ca2+濃度為0.2mol/L的條件下，選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液對磷脂酶聚集體進(jìn)行包埋，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉溶液對固定化酶活回收率的影響，結(jié)果見圖7。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時，酶活回收率最高，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加固定化酶活力降低。這是因為，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，微膠囊的強度增加，但在反應(yīng)過程中底物擴(kuò)散更加困難，因此表現(xiàn)為固定化酶活力降低。所以選擇海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。 2.2.4Ca2+濃度的確定

圖7 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對磷脂酶固定化的影響Fig.7 Effect of sodium alginate concentration on activity of immobilized PLA

在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.3%、交聯(lián)時間為6.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的條件下，選擇不同Ca2+濃度的CaCl2溶液進(jìn)行固定化，考察不同Ca2+濃度對固定化酶酶活回收率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 Ca2+濃度對磷脂酶固定化的影響Fig.8 Effect of Ca2+concentration on activity of immobilized PLA

由圖8可知，隨著Ca2+濃度增加，固定化酶活回收率增加。這是由于海藻酸鹽很容易與Ca2+作用，形成熱不可逆凝膠，可將酶固定化在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，凝膠強度與Ca2+濃度成正比[16]，但是Ca2+濃度過高時會與酶作用而使酶變性失活，因此，Ca2+濃度選擇在0.25mol/L為最佳。

2.3 正交試驗優(yōu)化交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的制備及包埋條件結(jié)果

由表2可知，4個因素對酶活回收率的影響大小依次為C＞B＞D＞A，即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞交聯(lián)時間＞Ca2+濃度＞戊二醛體積分?jǐn)?shù)；最佳制備條件A3B2C2D2，在此條件下經(jīng)驗證得到酶活回收率為80.2%，高于正交試驗中第2組試驗值79.8%。所以，交聯(lián)磷脂酶聚集體A1的最佳包埋條件為：戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.4%、交聯(lián)時間6.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、Ca2+濃度0.25mol/L。在該條件下，其酶活回收率為80.2%。

表2 正交試驗優(yōu)化交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的包埋條件結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests

2.4 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度

圖9 溫度對固定化酶相對酶活力的影響Fig.9 Effects of temperature on relative activity of immobilized phospholipase and free phospholipase

由圖9可知，游離酶在50℃時相對酶活力最高，而固定化酶在60℃相對酶活力最高，可見固定化酶的耐熱性優(yōu)于游離酶。

2.4.2 最適pH值

圖10 pH值對固定化酶相對酶活力的影響Fig.10 Effect of pH on relative activity of immobilized phospholipase and free phospholipase

由圖10可知，游離酶的最適pH值為4.8，而固定化酶的最適pH值為5.8，顯示固定化酶比游離酶較耐堿，有更寬泛的適應(yīng)性。

2.4.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

圖11 重復(fù)使用次數(shù)對固定化酶相對酶活力的影響Fig.11 Effect of repeated use frequency on relative activity of immobilized lipase

由圖11可知，固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性，在連續(xù)使用7個批次后其相對酶活力仍保持65%以上。相對酶活力的下降可能是由于在不斷攪拌下，固定化載體持水性發(fā)生變化，固定化酶凝膠結(jié)構(gòu)的改變和酶的泄漏所造成的結(jié)果。

2.5 包埋-交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的SEM圖像

圖12 包埋-交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的SEM圖像Fig.12 SEM images of encapsulation crosslinked phospholipase A1

圖12 中a、b分別為海藻酸鈉包埋的微膠囊冷凍干燥后顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖片。由圖12a可知，微球微表面形成致密的復(fù)合膜。因此，它能有效的防止磷脂酶從微膠囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收率。從圖12b中可觀察到，海藻酸鈉微膠囊為材料內(nèi)部具有規(guī)則蜂窩狀通孔結(jié)構(gòu)，孔徑都在幾微米以下，因而，其具有很大的內(nèi)表面積，能有效包埋、截留磷脂酶，并且這也有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。這種多孔的形成，主要是因冷凍干燥，使冰晶升華而形成蜂窩狀通孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有很大的內(nèi)表面積，可增加酶的包埋效率，提高磷脂酶與磷脂接觸的界面面積，同時，減小底物和產(chǎn)物在微膠囊內(nèi)部的擴(kuò)散阻力，提高反應(yīng)速度。

3 結(jié) 論

3.1 酶聚集體包埋-交聯(lián)固定化磷脂酶A1，提高了單一法所帶來的固定不穩(wěn)定及酶活回收率低等缺點，酶聚集體包埋-交聯(lián)最佳工藝條件為：酶液質(zhì)量濃度0.06g/mL、沉淀劑飽和度80%、沉淀pH6、沉淀時間35min、戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.4%、交聯(lián)時間6.5h、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、Ca2+濃度0.25mol/L。得到包埋-交聯(lián)磷脂酶聚集體A1的酶活回收率為80.2%。

3.2 SEM結(jié)果顯示：海藻酸鈉包埋后的微球內(nèi)部具有規(guī)則通孔結(jié)構(gòu)，孔徑較小，在幾微米以下，具有很大的內(nèi)表面積，能有效地包埋、截留磷脂酶，并且這也有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，固定化酶活力回收率較高。

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Preparation of Encapsulation-crosslinked Aggregates of Phospholipase A1

WANG Yan，WANG Xue，LI Yue，LI Zhi-ping，YU Dian-yu*
(College of Food Science, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China)

In order to prepare reusable immobilized phospholipase A1 with high activity, the encapsulation-crosslinked aggregate method was used. The immobilization conditions and partial properties of immobilized phospholipase were determined. Results indicated that the optimal preparation conditions were enzyme concentration of 0.06 g/mL, precipitant saturation degree of 80%, precipitation time of 35 min, glutaradehyde concentration of 0.4%, cross-linking time of 6.5 h, sodium alginate concentration of 0.2% and Ca2+concentration of 0.25 mol/L. Under the optimal preparation conditions, the recovery rate of enzyme activity was 80.2%. The thermal stability of immobilized phospholipase was better than that of free phospholipase. Meanwhile, after seventh repeated use, the relative activity of immobilized phospholipase still remained more than 65%.

phospholipase A1；precipitan；glutaraldehyde；cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)；immobilization；encapsulation；SEM

Q814.2

A

1002-6630(2012)05-0118-06