張大川，房國梁，李 琦，陳江源，王 嵐，李 睿，劉烈炬，劉志國

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 湖北 武漢 430023)

噬菌體基因Ⅴ蛋白基因的合成、重組表達(dá)及功能分析

張大川，房國梁，李 琦，陳江源，王 嵐，李 睿，劉烈炬，劉志國*

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 湖北 武漢 430023)

目的：研究絲狀噬菌體基因V蛋白(gene V protein，GVP)基因的合成、重組表達(dá)及其功能。方法：根據(jù)GVP的基因序列，選擇大腸桿菌偏愛的密碼子，設(shè)計合成了8個寡核苷酸片段，利用重疊延伸PCR合成GVP基因序列，將其與原核表達(dá)載體pET-28a-c(＋)質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得GVP蛋白陽性表達(dá)菌株，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)Ni+-NTA瓊脂糖凝膠層析純化，獲得目的蛋白GVP，DNA結(jié)合實驗檢測其功能。結(jié)果：成功合成出GVP基因，重組體在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)，DNA結(jié)合實驗表明GVP與單鏈DNA間解離平衡常數(shù)Kd=7.27×10-5mol/L。結(jié)論：重組構(gòu)建并高效表達(dá)的GVP蛋白具有較高單鏈DNA結(jié)合能力，可用于食品病原微生物特定單鏈DNA分子的濃縮和分離。

基因V蛋白(GVP)；大腸桿菌BL21(DE3)；重組；表達(dá)

絲狀噬菌體多可感染含F(xiàn)因子的大腸桿菌，基因V蛋白(gene V protein，GVP)主要是由Ff組的M13、F1、fd等絲狀噬菌體產(chǎn)生的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，由87個氨基酸殘基組成，為噬菌體DNA復(fù)制所必需，可使噬菌體DNA移動至細(xì)菌的細(xì)胞膜，屬于單鏈DNA結(jié)合蛋白，而且結(jié)合單鏈核苷酸與堿基序列無直接關(guān)系，該蛋白還可抑制翻譯活性，在病毒、原核生物的DNA復(fù)制、翻譯及遺傳重組等過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。

已有研究表明，利用GVP與單鏈DNA非特異性結(jié)合的特性，在核酸與蛋白質(zhì)相互作用、病原微生物的核酸檢測以及DNA測序等許多方面可有廣泛應(yīng)用，如利用某些單鏈DNA結(jié)合蛋白篩選生物標(biāo)本或樣品中單鏈核苷酸片段來研究某些外顯子的特性等[4-6]。可見該類DNA結(jié)合蛋白作為應(yīng)用工具有較高的價值。

野生型的GVP廣泛存在于細(xì)菌中，但含量較低且不易收集。本研究旨在利用重疊延伸PCR方法合成GVP基因序列，與質(zhì)粒重組并在大腸桿菌中高效表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)分離純化后進(jìn)行單鏈DNA(single strain DNA，ssDNA)結(jié)合力檢測，為食品等病原微生物中單鏈特性的DNA片段分離、濃縮及檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、質(zhì)粒pET-28a-c(+)由武漢工業(yè)學(xué)院生物技術(shù)研究室保存；限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I、T4連接酶 日本Toyobo公司；50bp DNA Ladder Marker 寶生物工程(大連)有限公司；1kb plus DNA Ladder 天根生化科技（北京）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國Axygen公司；DNA凝膠回收試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒小量制備試劑盒、中分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白上海捷瑞生物工程有限公司；蛋白胨、酵母浸提物 英國Oxiod公司；Ni+-NTA樹脂 Novagen公司；DNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 重組子pET-28a-c(+)-GⅤP的構(gòu)建

利用重疊延伸PCR方法[7]構(gòu)建目的基因，參照GeneBank上的GVP基因序列(Accession No. J02450)，將目的基因中的大腸桿菌稀有密碼子改為大腸桿菌偏愛密碼子，在其5＇端加EcoR I酶切位點，3＇端加XhoI的酶切位點，兩端各加兩個保護堿基。整個基因序列全長280bp，將其分8段合成DNA引物，相鄰兩段間各有18個堿基互補重疊。

8段引物分別為：Pr1：5＇- CGGAATTCATGATTAA AGTTGAAATT-3＇下劃線堿基為EcoRI酶切位點；Pr2：5＇- GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGA GACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT-3＇；Pr3：5＇-CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGT ATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT-3＇；Pr4：5＇-AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCACGT AACACAGCTGCTCATTCA-3＇；Pr5：5＇- CACCC GTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGT GAATGAGCAGCTGTGTT-3＇；Pr6：5＇-AACC GAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGA ACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG-3＇；Pr7：5＇-AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATC GTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA-3＇；Pr8：5＇-ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG-3＇。下劃線堿基為Xho I酶切位點。

利用相鄰引物間重疊互補的核苷酸片段互相搭橋，并各為模板，進(jìn)行3輪重疊延伸PCR[7]，最終將8片段連成目的基因[8-9]，以此目的基因為模板，Pr1和Pr8分別為上下游引物進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

分別用EcoR I和Xho I于37℃水浴雙酶切4h目的基因及質(zhì)粒pET-28a-c(+)，各自回收后，將酶切回收的目的基因和質(zhì)粒用T4 DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)10h；連接產(chǎn)物即重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒酶切并PCR擴增鑒定重組基因，并送交上海杰瑞生物工程有限公司測序檢測。測序結(jié)果與設(shè)計序列相符的重組子命名為pET-28a-c(+)-GVP。

1.3 重組子pET-28a-c(+)-GVP的表達(dá)

將重組子pET-28a-c(+)-GVP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落接種于含有卡那霉素(50μg/mL)的2mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，吸取少量過夜培養(yǎng)液按1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB(含有卡那霉素50μg/mL)培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(終濃度1.0mmol/L)誘導(dǎo)10h[10]。收集菌體提取蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測。

1.4 重組蛋白的純化

將誘導(dǎo)后的菌液于4℃、8000r/min離心20min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用1/10的裂解液 (NaH2PO420mmol/L、NaCl 0.5mol/L、1% TritonX-100，pH7.4)重懸，超聲波破碎，4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，加入終質(zhì)量濃度為5μg/mL的DNase和RNase，30℃水浴30min。使用Ni+-NTA瓊脂糖層析柱純化上清液中的目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)條件

1.5.1 IPTG濃度對GVP蛋白表達(dá)的影響

按1.3節(jié)方法分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)4h，收集菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.5.2 誘導(dǎo)時間對GVP蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)1.5.1節(jié)所得最佳濃度的IPTG分別誘導(dǎo)1、2、4、6、8h，收集菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 重組蛋白與單鏈DNA結(jié)合力的分析

純化后的GVP蛋白與Ni+-NTA瓊脂糖凝膠相偶聯(lián)。偶聯(lián)后的凝膠各取50μL，分別加入濃度分別為0.018、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180mol/L 的pET-28a-c(+)單鏈DNA(質(zhì)粒pET-28a-c(+)95℃變性10min，立即冰浴30min)，混勻，20℃孵育1h，3000×g離心5min，棄上清液；用洗滌液(磷酸鈉20mmol/L、NaCl 0.5mol/L，pH7.4)洗兩次，加入100μL洗脫液(磷酸鈉20mmol/L、NaCl 0.5mol/L、咪唑500mmol/L，pH7.4)洗脫，3000×g離心5min，取上清液。測上清液單鏈DNA濃度，繪制飽和曲線和Scatchard圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的合成及重組基因的鑒定

經(jīng)過第1輪重疊延伸PCR將8段引物合成4段核苷酸序列(圖1)。純化回收合成的4段序列，進(jìn)行第2輪重疊延伸PCR，進(jìn)一步合成兩個更大的片段，最后第3輪重疊延伸PCR合成目的基因片段(圖2)。提取轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 α陽性菌落質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR擴增，陽性重組質(zhì)?？梢郧谐雠c目的基因大小一致的片段，均為280bp(圖3)。陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果與設(shè)計完全相符，序列完整且閱讀框正確。

圖1 第1輪重疊延伸PCRFig.1 The first step of overlap extension PCR

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)及重組蛋白的純化

SDS-PAGE實驗結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量13×103處出現(xiàn)了表達(dá)條帶(圖4)，分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致，說明GVP蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)。使用Ni+-NTA樹脂純化目的蛋白，純化效果較好(使用Quantity One軟件分析計算純度達(dá)90%以上)。

圖4 重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.4 Expression and purification of recombinant protein

2.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 IPTG濃度對GVP蛋白表達(dá)的影響

在IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L，各誘導(dǎo)4h，發(fā)現(xiàn)在0.8mmol/L時，目的蛋白表達(dá)量最高(圖5)。

圖2 第2、3輪重疊延伸PCRFig.2 The second and third steps of overlap extension PCR

圖5 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對重組蛋白GVP表達(dá)的影響Fig.5 Effect of IPTG on the expression of recombinant GVP

圖3 重組基因電泳分析Fig.3 Electrophoretic analysis of recombinant genes

2.3.2 誘導(dǎo)時間對GVP蛋白表達(dá)的影響

以0.8mol/L的IPTG分別誘導(dǎo)1、2、4、6、8h，結(jié)果顯示誘導(dǎo)6h時目的蛋白表達(dá)量最大(圖6)。

圖6 誘導(dǎo)時間對重組蛋白GVP表達(dá)的影響Fig.6 Effect of induction time on the expression of recombinant GVP

2.4重組GVP蛋白與單鏈DNA結(jié)合實驗結(jié)果分析

GVP蛋白與單鏈DNA結(jié)合呈現(xiàn)飽和性，飽和結(jié)合量為0.04mol/mol GVP，與雙鏈DNA結(jié)合量為0.013mol/mol GVP，結(jié)合程度明顯低于單鏈DNA(圖7)。根據(jù)Scatchard作圖法[11]，以結(jié)合的ssDNA濃度/游離的ssDNA濃度對結(jié)合的ssDNA濃度作圖，得到一條高度相關(guān)直線(圖8)，由此可計算GVP蛋白與單鏈DNA結(jié)合的解離常數(shù)Kd值為7.27×10-5mol/L。

圖7 重組GVP與DNA的結(jié)合曲線Fig.7 Curve of DNA binding capacity of GVP

圖8 重組GVP與ssDNA結(jié)合力的線性關(guān)系圖Fig.8 Linear relationship between binding ssDNA concentration/free ssDNA concentration ratio and free ssDNA concentration

3 討 論

在大腸桿菌表達(dá)體系中，由于外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)受多種因素的影響，如啟動子和終止子的強弱、SD序列、密碼子的偏愛性、基因二級結(jié)構(gòu)、宿主菌的遺傳背景、培養(yǎng)條件等，其中尤以密碼子的偏愛性最為重要[12]。因此為了實現(xiàn)GVP基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，采用基因全合成的方式，使用大腸桿菌偏愛密碼子替換原密碼子，從基因水平上進(jìn)行優(yōu)化。

本實驗中將GVP基因分成了8段，其中的第1段和第8段為26bp，相對較短，并設(shè)計了酶切位點，以便用于擴增全長DNA片段及方便裝入載體中。重疊延伸PCR過程中，重疊堿基的數(shù)目既決定了每個片段的長度，又決定了擴增的效果，重疊數(shù)目過低不利于延伸的正確進(jìn)行。因此本實驗采用每段重疊18bp，以提高重疊延伸PCR的特異性[13-14]。

絲狀噬菌體編碼的GVP蛋白為87個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為9682。本實驗得到的重組GVP相對分子質(zhì)量約為13000，主要由目的基因與載體pET-28a(+)中表達(dá)氨基末端的一段6×His標(biāo)簽的序列進(jìn)行融合表達(dá)所致，這樣即可實現(xiàn)目的蛋白在宿主菌中的高效表達(dá)，同時His標(biāo)簽又為后續(xù)的重組蛋白分離純化提供了方便，利用重組蛋白上His標(biāo)簽與Ni+親和層析柱間高的親和力，洗滌雜蛋白純化目的蛋白。

通過DNA結(jié)合實驗顯示出重組GVP蛋白具有較好的單鏈DNA結(jié)合能力，對同一來源的雙鏈DNA親和作用明顯較低。結(jié)果表明所得的重組GVP蛋白與天然的GVP蛋白功能相同或相似，屬于DNA結(jié)合蛋白。

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Synthesis, Recombinant Expression and Functional Analysis of Filamentousphage Gene V Protein

ZHANG Da-chuan，F(xiàn)ANG Guo-liang，LI Qi，CHEN Jiang-yuan，WANG Lan，LI Rui，LIU Lie-ju，LIU Zhi-guo*
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Objective: To explore the gene synthesis, recombinant expression and functions of filamentousphage gene V protein (GVP). Methods: According to the gene sequence of GVP, eight oligonucleotide fragments with the selected E. coli-preferred codon were designed, and the GVP gene sequence was synthesized by overlap extension PCR. Then the synthesized sequence was inserted into pET-28a-c(+) plasmid. The recombinant plasmids obtained were transformed into E. coli to screen positive isolates of GVP. GVP expression in the positive strains was induced with IPTG. The recombinant proteins were purified by Ni+-NTA affinity chromatography. Results: GVP gene was successfully synthesized and highly expressed in E. coli BL21 (DE3) under the induction of IPTG, and the equilibrium dissociation constant was 7.27 × 10-5mol/L between GVP and ssDNA. Conclusion: The recombinant GVP has high affinity with ssDNA and therefore can be used for the ssDNA detection of some pathogenic microorganisms in food.

gene V protein；E. coli BL21 (DE3)；recombination；expression

Q782

A

1002-6630(2012)01-0191-04

2011-07-01

武漢市科技局對外科技合作與交流計劃項目(201070934341)；武漢市科技局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新平臺項目(201120637175-5)

張大川(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：zhangdachuan1985@163.com

*通信作者：劉志國(1963—)，男，教授，博士，研究方向為生物技術(shù)與食品安全。E-mail：zhiguo_l@126.com