張 旭，劉 燦，生吉萍，鄭嫣燕，徐 菲，申 琳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

食用菌致病木霉優(yōu)良拮抗菌株的篩選及生理特性的初步研究

張 旭，劉 燦，生吉萍，鄭嫣燕，徐 菲，申 琳*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

木霉是食用菌大規(guī)模人工栽培過(guò)程中的主要致病菌，為尋找安全、高效的拮抗菌，從食用菌培養(yǎng)基中分離得到283株細(xì)菌。通過(guò)平板對(duì)峙法，篩選出16株對(duì)木霉有強(qiáng)烈拮抗作用的菌株。選擇其中拮抗效果最明顯的6株細(xì)菌利用杯碟法測(cè)定其發(fā)酵上清液的抑菌效果，最終篩選出細(xì)菌B155，其發(fā)酵上清液對(duì)木霉的抑菌圈半徑達(dá)(19.02 ± 1.65)mm。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA鑒定，確定B155為地衣芽孢桿菌，并將其命名為B155 (B. licheniformis)。通過(guò)對(duì)B155菌株生理特性的初步研究，發(fā)現(xiàn)B155菌株的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0，最適接種量為1%。

食用菌；木霉；拮抗菌；地衣芽孢桿菌；生理特性

食用菌可以為人類提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，且味道鮮美。近幾年來(lái)我國(guó)食用菌消費(fèi)水平大幅度增高。由于食用菌生長(zhǎng)速度較快且對(duì)季節(jié)及場(chǎng)地面積要求較小，因而食用菌生產(chǎn)企業(yè)逐漸增多，但由于食用菌生長(zhǎng)及保藏的過(guò)程中，經(jīng)常受到霉菌特別是木霉[3-8]的污染，阻礙其生長(zhǎng)，并加速保鮮過(guò)程中產(chǎn)品的腐爛速度[9-11]，因而食用菌的污染導(dǎo)致食用菌產(chǎn)量的下降，對(duì)生產(chǎn)者造成經(jīng)濟(jì)效益下降，也影響到食用菌的食品安全性問(wèn)題。

針對(duì)食用菌的病害問(wèn)題，目前市場(chǎng)上常用的抑菌制劑大都為化學(xué)制劑，雖然效果確切，但存在副作用, 而且生產(chǎn)成本較高，嚴(yán)重的還會(huì)造成化學(xué)成分的殘留，引起了嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。針對(duì)此種情況，研究與開(kāi)發(fā)副作用小、不污染環(huán)境、來(lái)源于生物的天然抑菌制劑具有很大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。生物防治在防治植物病害方面的研究已經(jīng)有一定的基礎(chǔ)[12-13]，并成功地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際操作中。

食用菌中致病微生物生防制劑的研究是通過(guò)篩選和安全性鑒定，獲得能夠拮抗霉菌的安全細(xì)菌。在此研究領(lǐng)域，我國(guó)已有了一定程度的發(fā)展[14]。此外，通過(guò)近幾年對(duì)引起食用菌腐敗的致病微生物的研究，以及食用菌培養(yǎng)基中豐富微生物資源的初步利用[10]，都為優(yōu)良拮抗菌株的篩選提供了條件。但對(duì)于食用菌中病原微生物的研究目前仍處于起步發(fā)展階段，仍有很大的研究與創(chuàng)新空間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟹味菇培養(yǎng)基、雙孢菇培養(yǎng)基、白玉菇培養(yǎng)基、煙臺(tái)蟹味菇培養(yǎng)基、煙臺(tái)雙孢菇培養(yǎng)基由山東省九龍有限公司提供。

木霉指示菌為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院微生物菌種保藏與鑒定中心提供。

細(xì)菌培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L，pH7.2～7.4；發(fā)酵液培養(yǎng)基：5g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母浸粉、10g/L NaCl、pH值自然；真菌培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L、葡萄糖200g/L，自然pH 值；固體培養(yǎng)基中加入20g/L 瓊脂粉，121℃，20min 滅菌備用。

PCR生化試劑 寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒 天根科技生化(北京)有限公司；蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；DNP-9802型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái) 北京賽伯樂(lè)試驗(yàn)儀器有限公司；TC512 型PCR 儀 美國(guó)Barloworld Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌株的分離

取1g培養(yǎng)基用無(wú)菌研缽研磨并加入到9mL無(wú)菌生理鹽水中，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后吸取0.1mL涂布于細(xì)菌培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24～72h，挑取單菌落劃線純化。對(duì)已純化的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)，并保存待用。

1.3.2 抗木霉拮抗菌株的篩選

木霉的培養(yǎng)及孢子液的制備：木霉接入PDA 斜面(180mm×18mm)，28℃培養(yǎng)4d，待孢子充分形成后，每個(gè)試管中加入5mL 無(wú)菌的體積分?jǐn)?shù)0.5% Tween-80 溶液，充分振蕩后以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并以無(wú)菌水調(diào)整至107個(gè)/mL，4℃保存。

抗木霉優(yōu)良菌株的初篩：用打孔器將培養(yǎng)有木霉的培養(yǎng)基上打下大小相同的帶有木霉的培養(yǎng)基圓片，置于篩選培養(yǎng)基平板中心。將1.3.1節(jié)已分離純化的細(xì)菌菌株分別點(diǎn)種在LB固體培養(yǎng)基表面上。28℃培養(yǎng)3d，觀察細(xì)菌菌落周?chē)欠翊嬖谝志Σ⒂檬纸徊娣y(cè)量抑菌圈直徑。有抑菌能力的菌株用斜面保存。

抗木霉優(yōu)良菌株的復(fù)篩：使用PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉，待孢子長(zhǎng)滿斜面后，用無(wú)菌生理鹽水沖洗斜面，制成孢子懸浮液，并稀釋為101、103、105、107個(gè)/mL，4個(gè)濃度梯度。再將不同濃度梯度的木霉孢子接入PDA培養(yǎng)基平板中，28℃培養(yǎng)4d，待孢子充分形成待用。

挑出初篩篩出的抑菌效果好的細(xì)菌斜面保存的菌株，接入裝有50mL發(fā)酵液培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置于恒溫振蕩器中，28℃、140r/min培養(yǎng)48h。發(fā)酵液10000r/min離心10min，再經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，測(cè)定該無(wú)菌濾液的抑菌活性。將每個(gè)涂布有不同濃度梯度的木霉孢子平板中十字等距離放入四個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入100μL無(wú)菌濾液并靜置，28℃培養(yǎng)72h后十字交叉法測(cè)量抑菌圈半徑，以接種培養(yǎng)基上清液作為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：挑取少量目標(biāo)菌株在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)24h后觀察單菌落形態(tài)、形狀、大小、透明度、邊緣、表面、菌落及周?chē)囵B(yǎng)基的顏色等形狀，并進(jìn)行革蘭氏染色記錄菌體形態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再次染色，記錄菌體形態(tài)。

生理生化鑒定：將目標(biāo)菌株的發(fā)酵液接種于API 50生理生化指標(biāo)鑒定試劑盒中，于37℃培養(yǎng)，并在12、24、48h后觀察并記錄結(jié)果。

16S rDNA 鑒定：按照天根科技生化(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行。用細(xì)菌通用引物，正向引物16Sf：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物16Sr：5＇-GGCTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，33個(gè)循環(huán)；再進(jìn)行終延伸10min。

所得PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行檢測(cè)后送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。所得序列利用Blast 程序在GenBank 基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的幾株菌株的16S rDNA 序列，用Mega3.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 目標(biāo)菌株生長(zhǎng)特性的初步研究

1.3.4.1 最適生長(zhǎng)溫度的確定

將目標(biāo)菌株B155菌株接種至含50mL LB培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，置于不同發(fā)酵溫度(20、24、28、32、37、42℃)條件下，140r/min搖床培養(yǎng)24h，離心收集上清液，測(cè)600nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4.2最適生長(zhǎng)pH值的確定

將目標(biāo)菌株B155菌株分別接種至含50mL不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)LB液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，在最適生長(zhǎng)溫度條件下140r/min搖床培養(yǎng)24h，離心收集上清液，測(cè)600nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4.3 最適接種量的確定

將目標(biāo)菌株B155采用不同接種量(0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0% )接種至含50mL LB培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，在最適生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)pH值條件下140r/min搖床培養(yǎng)24h，離心收集上清液，測(cè)600nm波長(zhǎng)處的吸光度和活菌數(shù)。

1.3.4.4 最適培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將目標(biāo)菌株B155采用最適生長(zhǎng)溫度，最適生長(zhǎng)pH值及最適接種量接種至含50mL LB培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，置于140r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣，以未接種液體培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定A600nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A600nm為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌落的分離結(jié)果

從不同食用菌培養(yǎng)基共計(jì)16個(gè)樣品中分離得到有單一菌落形態(tài)的細(xì)菌283株，其中來(lái)源于蟹味菇培養(yǎng)基37株，雙孢菇培養(yǎng)基23株，白玉菇培養(yǎng)基26株，煙臺(tái)蟹味菇培養(yǎng)基21株，煙臺(tái)雙孢菇培養(yǎng)基176株，對(duì)分離所得細(xì)菌分別進(jìn)行斜面保藏和甘油保藏。

2.2 拮抗木霉優(yōu)良菌株的初篩及復(fù)篩結(jié)果

通過(guò)劃線接種法，在接有霉菌的平板上，距霉菌距離相等的4個(gè)方向分別劃長(zhǎng)度相等的沾有細(xì)菌的直線。從分離的283株細(xì)菌中，共篩出16株在抑菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中形成清晰透明圈的細(xì)菌。部分菌株產(chǎn)生的拮抗效果見(jiàn)圖1。由于木霉的最適生長(zhǎng)溫度在25～28℃，而細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度在30℃以上，實(shí)驗(yàn)中若始終在28℃條件下培養(yǎng)，某些細(xì)菌的抑菌效果不明顯，而37℃條件下木霉孢子不能萌發(fā)，超過(guò)24h后大部分孢子死亡。最終將實(shí)驗(yàn)條件確定為在37℃條件下培養(yǎng)8h后，移至28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

圖1 部分拮抗木霉細(xì)菌產(chǎn)生的拮抗效果Fig.1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on Trichoderma

選擇初篩抑菌效果明顯的6株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵上清液的抑菌活性測(cè)定來(lái)進(jìn)一步復(fù)篩優(yōu)良菌株，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 部分拮抗木霉細(xì)菌復(fù)篩抑菌效果Table1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria obtained from secondary screening on Trichoderma

從表1可以看出，6株細(xì)菌的發(fā)酵上清液均能產(chǎn)生抑菌圈，其中4號(hào)、5號(hào)菌株的抑菌效果較其他兩株明顯，可以抑制的孢子懸浮液濃度為107個(gè)/mL，透明圈的半徑為0.20、0.19cm，故確定目標(biāo)菌株為4號(hào)菌株，編號(hào)為B15 5。通過(guò)目標(biāo)菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)可得，其發(fā)酵上清液對(duì)木霉的抑菌圈半徑達(dá)(19.02 ± 1.65)mm。

2.3 目標(biāo)菌株的鑒定

2.3.1 菌株B155形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

B155號(hào)菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)時(shí)呈現(xiàn)乳白色半透明的圓形菌落，邊緣呈鋸齒狀，表面較光滑，菌落周?chē)囵B(yǎng)基顏色未發(fā)生改變。通過(guò)革蘭氏染色可知B155號(hào)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，且為產(chǎn)芽孢細(xì)菌。菌體為桿狀，芽孢為橢球形，如圖2所示。

圖2 B155號(hào)菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Morphology of strain B155

2.3.2 菌株B155生理生化鑒定結(jié)果

由表2可知，菌株B155接觸酶反應(yīng)、MR實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，卵磷脂水解呈陰性，能夠利用葡萄糖及淀粉，不能在4、1 0、55 ℃生長(zhǎng)，能在7% NaCl 溶液中生長(zhǎng)，這些結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]比對(duì)顯示菌株B155為地衣芽孢桿菌。

表2 菌株B155生理生化特性鑒定結(jié)果Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain B155

2.3.3 菌株B155 16S rDNA鑒定結(jié)果

圖3 菌株B155的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of strain B155

將菌株B155在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，與地衣芽孢桿菌同源性最高，高達(dá)99%。使用Mega 3.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。菌株B155與地衣芽孢桿菌處于同一發(fā)育水平上。根據(jù)表型特征、生理生化特性以及16S rDNA鑒定結(jié)果，可以判定菌株B155為地衣芽孢桿菌，并將其命名為地衣芽孢桿菌ABM 155 (B. licheniformis ABM 155)。

2.3.4 ABM155菌株生理特性的初步研究

通過(guò)測(cè)定地衣芽孢桿菌ABM 155 在不同生長(zhǎng)溫度的A600nm值，確定地衣芽孢桿菌ABM 155 最適生長(zhǎng)溫度為37℃(圖4A)。運(yùn)用同樣的方法，測(cè)定地衣芽孢桿菌ABM 155 在最適生長(zhǎng)溫度不同pH值條件下的A600nm值，確定ABM155的最適生長(zhǎng)pH值為7.0(圖4B)。在地衣芽孢桿菌ABM 155 最適生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)pH值條件下，其最適接種量為1%(圖4C)。

圖4 菌株B155最適生長(zhǎng)溫度、pH值、接種量的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Optimal growth temperature, pH and inoculum amount of strain B155 strain

根據(jù)測(cè)定的地衣芽孢桿菌ABM 155 在最適生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)pH值及最適接種量條件下隨發(fā)酵時(shí)間的A600nm值及活菌數(shù)，確定地衣芽孢桿菌ABM 155 生長(zhǎng)曲線，具體結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中地衣芽孢桿菌ABM155的A600nm值變化Fig.5 Change of A600nmduring the fermentation of ABM155

由ABM155的生長(zhǎng)曲線可知，菌株在0～5h生長(zhǎng)較為緩慢，該階段為菌株生長(zhǎng)的延滯期，在5～14h生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而在14h以后，吸光度變化較小，為目標(biāo)菌株ABM155的穩(wěn)定期。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從不同食用菌培養(yǎng)基共計(jì)16個(gè)樣品中分離得到283株芽孢桿菌，通過(guò)平板對(duì)峙法及杯碟法測(cè)定其發(fā)酵液的抑菌效果，最終篩選出一株芽孢桿菌ABM155，其發(fā)酵上清液對(duì)木霉的抑菌圈直徑達(dá)到(19.02 ± 1.65)mm，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測(cè)定及16S rDNA 序列分析，最終將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌ABM155。通過(guò)對(duì)其生理特性的初步研究得出地衣芽孢桿菌ABM155 菌株最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0，最適接種量為1%。本實(shí)驗(yàn)所選的菌種均分離自健康食用菌培養(yǎng)基，主要是考慮到以下幾個(gè)因素：1)健康食用菌培養(yǎng)基細(xì)菌種類豐富；2)健康食用菌培養(yǎng)基中可能會(huì)含有抑制木霉的拮抗菌株；3)健康食用菌培養(yǎng)基無(wú)論是對(duì)人體還是對(duì)食用菌自身的生長(zhǎng)而言安全性較高?；谝陨?點(diǎn)可以提高本實(shí)驗(yàn)獲得安全、高效抑制致病木霉的優(yōu)良細(xì)菌菌株的效率。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，從健康食用菌培養(yǎng)基中可分離出較大數(shù)量拮抗木霉的菌株，其中一部分對(duì)木霉產(chǎn)生明顯的拮抗效果。很多優(yōu)良的拮抗菌株如枯草芽孢桿菌己成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[16]。向晶晶等[17]篩選得到污染食用菌培養(yǎng)基的青霉的拮抗菌蠟樣芽孢桿菌，在田間實(shí)驗(yàn)中，所分離的抗菌物質(zhì)原液抑菌率達(dá)到80%，在食用菌病害的生物防治上取得良好的效果。本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙淹瓿赊卓咕甑暮Y選及生理生化特性的初步研究，今后將集中對(duì)抑菌物質(zhì)的分離、純化以及抑菌機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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Screening, Identification and Physiological Characteristics of Antagonistic Bacteria against Trichoderma in Mushroom

ZHANG Xu，LIU Can，SHENG Ji-ping，ZHENG Yan-yan，XU Fei，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Trichoderma can widely contaminate mushroom and result in the decay of mushroom. In order to screen antifungal bacteria for the application in mushroom cultivation industry, 283 strains were isolated from 16 kinds of cultivation media. Of them, 16 exhibited obvious antifungal activity against Trichoderma, and 6 with the strongest antagonistic activity were screened out and the inhibitory effects of their fermentation supernatants were tested by the cup method. As a result, the best strain named as B155 was screened out with an inhibition zone radius of (19.02 ± 1.65) mm. According to morphological, physiological and biochemical characteristics as well as partial 16S rDNA sequence analysis, strain B155 was identified as B. licheniformis and designated as ABM 155. The optimal growth temperature, pH and inoculum amount for the strain were 37 ℃, 7.0 and 1%, respectively.

mushroom；Trichoderma；antagonistic bacteria；B. licheniformis；physiological characteristics

Q93.331

A

1002-6630(2012)01-0186-05

2011-05-21

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200803033)

張旭(1990—)，女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：zhangxu19901218@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ膛c農(nóng)產(chǎn)品綜合利用。E-mail：pingshen@cau.edu.cn