努爾古麗·熱合曼，華長(zhǎng)春，朱曉瑩，古麗蘇木·托克遜，董明盛,*

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

新疆柯爾克孜族傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎中微生物群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析

努爾古麗·熱合曼1，華長(zhǎng)春2，朱曉瑩1，古麗蘇木·托克遜1，董明盛2,*

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

采用PCR-DGGE技術(shù)分析新疆柯爾克孜民族古老傳統(tǒng)發(fā)酵飲料——博扎(Bozaa)中微生物種群結(jié)構(gòu)，對(duì)博扎細(xì)菌和酵母菌DGGE圖譜上主要條帶的DNA進(jìn)行測(cè)序和序列分析。結(jié)果表明，博扎中細(xì)菌組成包括植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，初步成功解析評(píng)估了博扎中微生物的多樣性。

博扎；變性梯度凝膠電泳；微生物區(qū)系

博扎(Bozaa)是一種用小米粉自然發(fā)酵而成的發(fā)酵飲料，其制作和保藏工藝天然傳統(tǒng)，是一種酒精濃度較低，有CO2殺口感，低糖度，質(zhì)地濃稠的天然發(fā)酵飲料。博扎起源可追述到居住于前奧托曼土耳其的古老名族，作為一種健康飲品延續(xù)至今，不僅在其原產(chǎn)地仍然盛行，也已經(jīng)廣泛傳播至美洲、亞洲等地區(qū)，至今只有在我國(guó)新疆部分地區(qū)的柯爾克孜族家庭保留著制作和飲用博扎的習(xí)慣。作為傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品，獨(dú)特的發(fā)酵方式?jīng)Q定了其中微生物區(qū)系的多樣性，其中微生物菌系十分復(fù)雜，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，也是優(yōu)良益生菌的來源。但有關(guān)新疆柯爾克孜族傳統(tǒng)發(fā)酵飲料及其中的益生菌至今處在瀕危狀態(tài)，有關(guān)博扎的研究可以說還屬于空白，國(guó)內(nèi)外未見關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究可以說是在工業(yè)化時(shí)代，對(duì)古老傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎中的微生物組分的挽救工作。

近年來，基于16S rDNA的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)為有效分析復(fù)雜微生物群落及其多樣性提供了一種先進(jìn)手段[1]。本研究采用PCR-DGGE指紋技術(shù)，解析博扎中微生物種群結(jié)構(gòu)，揭示其中優(yōu)勢(shì)菌群組成，以為確定博扎飲料發(fā)酵優(yōu)勢(shì)微生物組分提供科學(xué)線索的同時(shí)，為進(jìn)一步研究博扎的發(fā)酵機(jī)制、其質(zhì)量控制以及此類發(fā)酵飲料今后的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

博扎樣品均采自新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇溫宿縣柯爾克孜族家庭，自然發(fā)酵1d后放置冰盒內(nèi)空運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，并在第2天處理樣品。

DNA提取試劑盒、PCR-supermix試劑 天根生化科技(北京)有限公司；DGGE試劑 美國(guó)Sigma公司；引物 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler梯度PCR 儀、Bio-Rad Dcode System 美國(guó)Bio-Rad公司；CDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及酵母菌基因組提取試劑盒從博扎樣品中直接提取細(xì)菌總DNA和酵母總DNA。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR-DGGE分析

1.3.2.1 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌PCR擴(kuò)增對(duì)象為細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)：上游引物為UGC 968- F(5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3＇)，下游引物為L(zhǎng)1401R(5＇-GCG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)[1-2]。酵母菌PCR擴(kuò)增對(duì)象為酵母菌26S rDNA的D1區(qū)；上游引物為NL1GC-f(5＇-GCG GGC CGC GCG ACC GCC GGG ACG CGC GAG CCG GCG GCG GGC CAT ATC AAT AAG CGG AGG AAA AG-3＇)，下游引物為L(zhǎng)S2(5′-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3＇)[3-4]。

PCR 反應(yīng)體系(50μL)：模板DNA 2μL，1×PCR緩沖液，0.2mmol/L dNTP，引物均為0.5μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.25U，補(bǔ)充ddH2O至終體積50μL[3,5]。

PCR擴(kuò)增采用梯度PCR儀。PCR條件采用降落PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，先20個(gè)循環(huán)(94℃ 變性30s，退火溫度65～55℃，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，退火30s，72℃延伸30s)，再于恒定退火溫度條件下進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

1.3.2.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

8%聚丙烯酰胺凝膠 (丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺體積比37.5:1)。變性梯度從40%到60%(100%變性劑含有7mol/L 尿素和40%甲酰胺)，在1×TAE 緩沖液中，先200V 預(yù)電泳5～10min，然后在85V 的固定電壓條件下電泳12～14h[7-8]。

1.3.2.3 染色(銀染和EB染色)

銀染是在電泳完成后將膠取出先置于一個(gè)干凈的不銹鋼或塑料容器中，加入200mL固定液，搖3 min；將固定液倒在容器中(后面操作使用)；添加200mL銀染溶液，搖10min；棄去銀染溶液，用蒸餾水輕洗膠和容器；添加新鮮蒸餾水，搖2min；棄去蒸餾水，加顯影溶液，直至出現(xiàn)清晰條帶為止，結(jié)束顯影，棄去顯影溶液。加入使用過的固定液，搖5min；棄去固定液，加入蒸餾水，搖2min，棄去蒸餾水；加入保存溶液，搖7min；銀染后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相。圖像用Quantity one分析軟件進(jìn)行分析[8-9]。

EB染色是在將DGGE膠在1×TAE(含0.5mg/L EB)中浸泡15min，棄去浸泡液，再在ddH2O中浸泡20min。然后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相[9]。

1.3.2.4 DNA條帶的回收

將EB染色的DGGE膠置于紫外燈下，切下不同位置的條帶，將凝膠條剪成許多細(xì)小片，將碎片分別轉(zhuǎn)移入1.5mL 離心管中；用洗脫緩沖液覆蓋凝膠碎片并于37℃溫育過夜；室溫6000r/min離心10min，以沉淀凝膠碎片；移出上清液，注意不要混有聚丙烯酰胺碎片，另用洗脫緩沖液洗滌聚丙烯酰胺凝膠碎片，回收殘存的DNA，必要時(shí)再離心，合并兩次上清液；DNA用兩倍體積100%乙醇沉淀，-20℃冷凍30min，12000r/min離心10min，DNA沉淀以100μL TE緩沖液重新溶解。往DNA溶液中加入10μL 3mol/L pH5.2的乙酸鈉、兩倍體積100%乙醇，重復(fù)沉淀過程，12000r/min離心10min回收DNA；沉淀物用70%乙醇洗滌、干燥、用TE緩沖液重新溶解[10]。

1.3.2.5 測(cè)序及相似性分析

以回收DNA為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，細(xì)菌引物為：上游引物968- F(5＇-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3＇)，下游引物L(fēng) 1401R(5＇-GCG TGT GTA CAA GAC CC- 3＇)；酵母菌引物為：NL1(5＇-GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G -3＇)和LS2(5＇-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3＇)。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min，30個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)和酵母菌的26S rDNA的D1區(qū)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用EditSeq程序進(jìn)行拼接。登陸NCBI(www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/)網(wǎng)站，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比較。用Clustal1.83 和Mega 軟件進(jìn)行相似性分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分類地位并將序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫得到登陸號(hào)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 博扎中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE圖譜分析

以提取的博扎中細(xì)菌總DNA為模板，用16S rDNA的V6～V8可變區(qū)引物(帶GC夾)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有樣品都檢測(cè)到大小約為440bp的特異性擴(kuò)增片段，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)采用的DNA提取方法及PCR擴(kuò)增條件是合適的(圖1)；用26S rDNA的D1 區(qū)引物(帶GC 夾)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得300bp 的特異性擴(kuò)增片段(圖2)。

圖 1 博扎中細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification products of 16S rDNA V6-CV8 fragments from Bozaa

圖2 博扎中酵母菌26S rDNA D1區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification products of yeast 26S rDNA D1 fragments from Bozaa

分別對(duì)得到反映博扎中細(xì)菌的16S rDNA V6～V8區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物和酵母菌26S rDNA D1區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳檢測(cè)，分別得到反映博扎中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的DGGE指紋圖(圖3)和反映博扎中酵母菌種群結(jié)構(gòu)的DGGE指紋圖(圖4)。

圖3 博扎中細(xì)菌菌落PCR-DGGE指紋圖譜菌相分析Fig.3 DGGE fingerprinting of bacterial communities in Bozaa

圖4 博扎中酵母菌落PCR-DGGE指紋圖譜菌相分析Fig.4 DGGE fingerprinting of yeast communities in Bozaa

從圖3可以看出，細(xì)菌圖譜中出現(xiàn)4條條帶；從圖4可以看出，酵母菌圖譜中出現(xiàn)1條條帶，在空白對(duì)照泳道中沒有出現(xiàn)條帶，說明出現(xiàn)的條帶可以特異性代表博扎微生物種屬。

2.2 割膠回收條帶及其分子比對(duì)

將純化DGGE膠上的DNA條帶，并對(duì)此片段擴(kuò)增、測(cè)序，經(jīng)過Blast程序比對(duì)，確定條帶A的序列與巴氏醋酸桿菌相似性達(dá)99%，條帶B與植物乳桿菌相似性達(dá)99%，條帶C與蠟狀芽孢桿菌相似性達(dá)99%，條帶D與短乳桿菌相似性達(dá)99%，條帶I與啤酒酵母菌相似性達(dá)99%。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的條帶序列都已被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，其登錄號(hào)見表1。

表1 博扎中細(xì)菌和酵母菌序列分析Table1 Results of sequence analysis of bacterial and yeast communities in Bozaa

3 討 論

博扎主要產(chǎn)地為中亞、中東和非洲地區(qū)部分國(guó)家，作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，其發(fā)酵過程中的微生物構(gòu)成復(fù)雜。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)產(chǎn)自土耳其等國(guó)家的博扎中的微生物采用傳統(tǒng)方法分離與鑒定，從研究結(jié)果來看，其中蘊(yùn)藏著豐富的對(duì)人體具有益生作用的特殊微生物資源，包括乳酸菌及酵母菌。在博扎飲料微生物組分研究方面，由于在國(guó)內(nèi)，除了小米發(fā)酵飲料及酒方面有些研究報(bào)道，但與其制作工藝及風(fēng)味等方面有一定的區(qū)別[12]。

在國(guó)外，關(guān)于博扎飲料微生物組成及其優(yōu)勢(shì)菌的分離鑒定方面有研究報(bào)道。Botes等[13]學(xué)者對(duì)土耳其發(fā)酵飲料博扎樣品微生物組成研究表明，Lactobacillusparacasei subsp. paracasei、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus rhamnosus 和Lactobacillus fermentum等乳酸菌和Candida diversa、Candida inconspicua、Candida pararugosa、Issatchenkia orientalis、Pichia fermentans、Pichia guillliermondii、Pichia norvegensis、Rhodotorula mucilaginosa 和Torulaspora delbrueckii 等酵母菌參與博扎的發(fā)酵過程。

本研究結(jié)果初步得到新疆柯爾克孜族家庭博扎飲料中微生物組成包括：植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)和蠟狀芽孢桿菌(B a c i l l u s c e r e u s)等細(xì)菌；酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此研究結(jié)果與之前國(guó)外學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果也有共同點(diǎn)，植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)等菌不同地區(qū)博扎飲料中普遍存在；但是新疆柯爾克孜族家庭博扎中分離得到的巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)在以前的研究結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)。此外關(guān)于酵母菌的結(jié)果也有不同之處，本研究結(jié)果中酵母菌發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，這可能與本研究樣品的數(shù)量有關(guān)，應(yīng)該進(jìn)一步對(duì)來自不同環(huán)境、不同家庭里發(fā)酵的博扎飲品作為材料進(jìn)一步研究比較其中的優(yōu)勢(shì)菌，找出相對(duì)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)菌群。

從以上研究結(jié)果可見，不同國(guó)家、同一國(guó)家不同地區(qū)以及同一地區(qū)不同家庭發(fā)酵的博扎中的微生物組成有一定的差異，因此其風(fēng)味也有所差異。這說明不同來源的博扎，因?yàn)榈貐^(qū)差異、工藝及制作環(huán)境等方面不同等原因，其中微生物的種群結(jié)構(gòu)具有一定差異，此外也可以說是不同研究方法所得到的結(jié)果差異，因此用分子生物學(xué)方法[16]解析其中所含的細(xì)菌及酵母菌對(duì)分離純化發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物具有指導(dǎo)作用并具有更深刻的意義。

[1]ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56 (3): 297-314.

[2]ERCOLINI D, FRISSO G, MAURIELLO G, et al. Microbial diversity in natural whey cultures used for the production of Caciocavallo Silano PDO cheese[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124 (2): 164-170.

[3]COCOLIN L, AGGIO D, MANZANO M. An application of PCRDGGE analysis to profile the yeast populations in raw milk[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(5): 407-411.

[4]AILIN B E H, FLEET G H, PRAKITCHAIWATTANA C, et al. Evaluation of molecular methods for the analysis of yeasts in foods and beverages [M]//HOCKING A D, PITT J I, SAMSON R A, et al. Advances in food mycology. USA: Springer Science+Business Media, Inc, 2006: 69-106.

[5]COCOLIN L, INNOCENTE N, BIASUTTI M, et al. The late blowing in cheese: a new molecular approach based on PCR and DGGE to study the microbial ecology of the alteration process[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 90(1): 83-91.

[6]DOLCI P, ALESSANDRIA V, COCOLIN G, et al. Microbiological characterization of artisanal Raschera PDO cheese: analysis of its indigenous lactic acid bacteria[J]. Food Microbiology, 2008, 25(2): 392-399.

[7]LEE J S, HEO G Y, LEE J W, et al. Analysis of kimchi microflora using denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102(2): 143-150.

[8]FLOREZ A B, MAYO B. Microbial diversity and succession during the manufacture and ripening of traditional, Spanish, blue-veined Cabrales cheese, as determined by PCR-DGGE[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 110(2): 165-171.

[9]FASOLI S, MARZOTTO M, RIZZOTTI L, et al. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 82(1): 59-70.

[10]奧斯伯F, 布倫特 R. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 金友新, 包慧中, 譯. 北京: 中國(guó)科技出版社: 31-32.

[11]羅靜初. 生物信息學(xué)概論[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 2002: 97-113.

[12]龔院生, 姚艾東, 王成中. 小米發(fā)酵飲料的研制[J]. 鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào), 1999(3): 41-45.

[13]BOTES A, TODOROV S D, von MOLLENDORFF J W, et al. Identification of lactic acid bacteria and yeast from Bozaa[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(2): 267-270.

[14]HANCIOGLU O.., KARAPINAR M. Microflora of Bozaa, a traditional fermented Turkish beverage[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 35(3): 271-274.

[15]GOTCHEVA V, PANDIELLA S S, ANGELOV A, et al. Microflora identification of the Bulgarian cereal-based fermented beverage Bozaa[J]. Process Biochemistry, 2000, 36(1/2): 127-130.

[16]高蕙文, 呂欣, 董明盛. PCR-DGGE指紋技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(8): 465-468.

PCR-DGGE Analysis of Microbial Community Structure of Bozaa, a Traditional Kyrgyz Fermented Beverage

Nurgul RAHMAN1，HUA Chang-chun2，ZHU Xiao-ying1，Gulsum TOHSUN1，DONG Ming-sheng2,*

(1.School of Life Sciences, Xinjiang Normal Univery, Urumq 830054, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The microbial community structure of Bozaa, a traditional Kyrgyz fermented beverage, was analyzed by the PCRDGGE technique. PCR amplification of 16S rRNA gene V6-V8 region and 26S rDNA D1 region were performed for bacteria and yeast in the beverage, respectively. The main DNA bands in the DGGE profiles of the PCR products obtained were subjected to sequence analysis. The results showed that the microbial flora of Bozaa was composed of Lactobacterium plantarum, Lactobacillus brevis, Bacillus cereus, Acetobacer pasteurianus, and Saccharomyces cerevisiae, which was a successful primary elucidation of the microbial diversity of Bozaa.

Bozaa；denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)；microflora

TS201.3

A

1002-6630(2012)01-0111-04

2011-08-17

新疆師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31050005)

努爾古麗·熱合曼(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：nurgul0716@sohu.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn