渠 暢，潘 晶，莊長福，張加研，田 珩，秦永劍

（1.西南林業(yè)大學(xué)材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224；2.廣西民族大學(xué)，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西 南寧 530006）

抗氧化劑和氧自由基方面的研究是近年來生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)界非常引人關(guān)注的領(lǐng)域。自由基與人的病理、生理有密切關(guān)系，防止自由基的氧化作用，對防治疾病保障健康具有積極意義[1]。自由基可通過體內(nèi)抗氧化劑來清除，但機(jī)體內(nèi)抗氧化劑往往不足，所以尋找外源性抗氧化劑對于預(yù)防疾病發(fā)生和保持機(jī)體健康是十分有益的[2]。

研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物可以延緩腫瘤的發(fā)作，減慢腫瘤的形成，提高認(rèn)知功能，抑制低密度蛋白氧化及抑制血小板凝集等功能[3]，這些功能都與酚羥基的抗氧化性能有關(guān)。具有鄰二酚羥基的酚類化合物是高效抗氧化劑。鄰二酚羥基的鄰位酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵，有利于酚氧自由基的穩(wěn)定；鄰二酚羥基的酚羥基與氧自由基反應(yīng)形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[4]?？寡趸瘎┬纬砂膈阶杂苫椒€(wěn)定，其清除自由基的能力就越強(qiáng)。

在不同環(huán)境下，抗氧化劑的活性也有很大變化。Ingold 等人研究發(fā)現(xiàn)，同一抗氧化劑在不同的溶劑中與相同自由基反應(yīng)的速率常數(shù)差別很大[5~8]。Nau等人報道在模擬生物膜體系中，隨著pH值的降低，維生素C 的抗氧化活性增強(qiáng)[9]。

本文首先研究鄰苯二酚及其衍生物（4- 甲基兒茶酚、對叔丁基鄰苯二酚和咖啡酸）捕獲ABTS+·自由基的性能，然后通過改變?nèi)芙忄彵蕉蛹捌溲苌锏娜軇┑乃釅A性，在不同條件下研究這些化合物的抗氧化性。

1 實(shí)驗部分

1.1 材料與儀器

精密電子天平JJ200，紫外可見分光光度計TU-180。

鄰苯二酚，4- 甲基兒茶酚，咖啡酸，對叔丁基鄰苯二酚，ABTS，無水乙醇，冰乙酸，吡啶，過硫酸鉀（均為分析純）。

1.2 試樣制備

稱取一定質(zhì)量的鄰苯二酚、4- 甲基兒茶酚、對叔丁基鄰苯二酚、咖啡酸，分別用無水乙醇溶解并定容至100mL，制成樣品母液，得到母液濃度為0.1mM。分別取 3 組 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL 0.1mM 的母液于5個10mL的容量瓶中作為樣品待測液。

1.3 ABTS+·清除能力測定

配制ABTS+·儲備液：配制4.0mM的ABTS及1.41mM的K2S2O8的蒸餾水溶液2.0mL，在室溫、避光條件下靜置16h。配制ABTS+·測定液：將ABTS+·儲備液用無水乙醇稀釋至100mL，使ABTS+·溶液終濃度約80μM。

測定：取2mL ABTS+·測定液及2mL 樣品待測液加入同一比色管中，震蕩搖勻30min后，測定其在734nm 波長處的吸光度（Absdetect），再測定2.0mL ABTS+·溶液與2.0mL無水乙醇的吸光度（Absref）作為空白組。每隔一段時間測定1次，至2次所測相差10%以內(nèi)反應(yīng)達(dá)到平衡，每組均為3次平行測量平均值。ABTS+·清除率按以下公式計算：

ABTS+·/% = （Absref-Absdetect）/Absref

以乙醇為溶劑溶解鄰苯二酚及其衍生物，測試捕獲ABTS+·的能力，然后在反應(yīng)體系中引入醋酸和吡啶，分別使其濃度達(dá)到130mM，并測試捕獲ABTS+·的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇溶劑中鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應(yīng)

由圖1鄰苯二酚及其衍生物在乙醇中與ABTS+·作用達(dá)到平衡時捕獲ABTS+·時的IC50，列于表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)在無水乙醇溶劑中，捕獲ABTS+·的相對抗氧化能力順序為：咖啡酸＞鄰苯二酚＞4- 甲基兒茶酚＞對叔丁基鄰苯二酚。這是和抗氧化劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)。鄰位酚羥基可以形成分子內(nèi)氫鍵，有利于生產(chǎn)更穩(wěn)定的酚氧自由基，抗氧化劑形成的自由基越穩(wěn)定，其清除自由基的能力就越強(qiáng)。由于咖啡酸具有較大的共軛體系，其羥基與ABTS反應(yīng)后形成的自由基可被大的共軛體系所穩(wěn)定，此外，咖啡酸中的取代基的雙鍵增強(qiáng)了共軛效應(yīng)，使酚羥基的氫離子更容易離去，因此捕獲自由基的能力最強(qiáng)。而甲基和叔丁基取代基在共軛基團(tuán)中是吸電子基團(tuán)，使酚羥基的氫離子不容易被脫去，叔丁基的吸電子效應(yīng)還強(qiáng)于甲基，更不容易脫去氫離子。

圖1 鄰苯二酚及其衍生物 - 醇 -ABTS+·

2.2 酸性條件下鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應(yīng)

由圖2鄰苯二酚及其衍生物在冰醋酸中與ABTS+·作用達(dá)到平衡時捕獲ABTS+·時的IC50，列于表1。由圖2及表1中的數(shù)據(jù)，可以看到這4種抗氧化劑在冰醋酸 - 乙醇溶液中時相對抗氧化能力的IC50和在乙醇中變化不大。這說明酸的加入減弱了抗氧化性。這是因為冰醋酸和抗氧化劑本身都是氫原子給予體，一方面冰醋酸抑制了鄰苯二酚及其衍生物OH給出氫離子的能力，而另一方面冰醋酸作為氫原子給予體也電離出一部分氫離子，從而使鄰苯二酚及其衍生物的IC50值基本不變。

圖2 鄰苯二酚及其衍生物 - 酸 -ABTS+·

2.3 堿性條件下鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應(yīng)

由圖3鄰苯二酚及其衍生物在吡啶中與ABTS+·作用達(dá)到平衡時捕獲ABTS+·的IC50，列于表1。由圖3中的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)在吡啶 - 乙醇溶液中，鄰苯二酚及其衍生物捕獲ABTS+·的IC50值比在乙醇溶液中減小很多，這說明吡啶的加入，增強(qiáng)了抗氧化劑的清除自由基的能力。這是由于在吡啶的堿性條件下，促進(jìn)抗氧化劑更容易電離出氫離子，從而使鄰苯二酚及其衍生物的IC50值減小，清除自由基能力增強(qiáng)。

圖3 鄰苯二酚及其衍生物 - 堿 -ABTS+·

表1 在乙醇，醋酸- 乙醇，吡啶- 乙醇溶液中，鄰苯二酚及其衍生物捕獲ABTS+·的IC50值

3 結(jié)論

（1）鄰苯二酚及其衍生物對自由基ABTS+·清除能力與抗氧化劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)。鄰位酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵，有利于生產(chǎn)更穩(wěn)定的酚氧自由基抗氧化劑?？Х人嶂械碾p鍵增強(qiáng)了共軛效應(yīng)，使OH的氫離子更容易離去。而甲基和叔丁基取代基在共軛基團(tuán)中是吸電子基團(tuán)，使OH的氫離子不容易被脫去。

（2）鄰苯二酚及其衍生物對自由基ABTS+·清除能力與溶劑的酸堿性有關(guān)。在酸性條件下，冰醋酸抑制了鄰苯二酚及其衍生物給出氫離子的能力，但作為氫給予體也電離出部分氫離子，清除能力變化不大；堿性條件下，促進(jìn)鄰苯二酚及其衍生物更容易電離出氫離子，清除自由基能力增強(qiáng)。

[1] 孫存普，張建中，段紹瑾.自由基生物學(xué)導(dǎo)論[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1999.1-47.

[2] 梁英，韋玉龍，許睿，等.蔗渣纖維素的自由基清除活性研究[J].桂林電子科技大學(xué)學(xué)報，2010，（5）：506-507.

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[4] 尚亞靖.酚類抗氧化劑的結(jié)構(gòu)修飾及其細(xì)節(jié)性機(jī)制研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2010.

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[9] Gramlich G, Zhang J, Nau W M. Increased Antioxidant Reactivity of Vitamin C at Low pH in Model Membranes [J].J Am Chem Soc, 2002, 124：11252-11253.